Ⅰ. 서 론

방사성동위원소 등을 이용하는 기관에서는 대부분 전리 방사선을 이용한다. 전리방사선이 인체 내로 들어오게 되면 생체 내 분자들과 반응하게 된다. 방사선에 의한 손상은 DNA와 조직에 직접 손상을 입히는 직접 작용과 물과 반응 하여 자유라디칼을 생성하고 자유라디칼에 의해 손상을 받 는 간접 작용으로 나뉜다. 인체는 약 70%가 물로 이루어져 있어 간접 작용으로 손상을 받을 확률이 방사선으로 인한 손상의 약 75% 정도 된다[1-2]. 방사선 방호제는 방사선에 의한 인체 조직의 손상으로부터 방호 작용을 할 수 있는 의 약품이다. 현재 사용되고 있는 방사선 방호제들은 주로 SH 화합물이다. SH 화합물은 자유라디칼과 반응하여 소거함으 로써 자유라디칼이 인체 분자와 반응하지 못하게 만든다[3]. 아미포스틴(Amiforstine), 시스테아민(Cysteamine), 시스테 인(Cystein) 등을 사용하는데, 자체적으로 독성을 가지고 있 어 구토나 두통, 소화불량 등 부작용이 있다. 따라서 이를 방 지하고자 천연물질로 방사선 방호 작용이 있는 천연 방사선 방호제 연구가 필요하다[4]. 구절초(Dendranthema zawadskii var. latilobum (Maxim.) kitam.)는 우리나라 전역의 산과 들에서 흔히 볼 수 있는 국화과 국화속에 속하는 다년생 식 물이다[5]. 또한 오래전부터 부인병 치료와 예방을 위한 한 약재로 사용되어왔다. 구절초에는 루테올린, 루테올로사이 드, 린나린[6-7] 등 플라보노이드 화합물과 클로로겐산, 아 피게닌[8] 등 페놀 화합물들이 많이 포함되어 있다. 플라보 노이드, 페놀 화합물들은 자유라디칼을 소거할 수 있는 항 산화 물질이며, 항산화 활성이 있다. 또한 루테올린과 루테 올로사이드는 체내의 항산화 효소 활성을 증가시켜 항산화 효과와 더불어 항산화 활성에 좋은 시너지를 낸다는 연구 결과가 있었다[9]. 클로로겐산은 항균 작용도 하는데, 주로 소장에서 흡수되어 장내의 산화 스트레스를 줄여주는 연구 결과가 있었다[10]. 구절초는 이러한 약리작용으로 인하여 항산화 물질 연구와 항염, 항암에 관한 연구들이 진행되고 있지만, 방사선 피폭에 대하여 방호효과에 관한 연구는 전 무한 상황이다. 구절초에는 항산화 물질이 많이 포함되어, 방사선에 의해 생성된 자유라디칼로부터 체내 분자들을 보 호할 수 있을 것으로 생각된다. 따라서 본 연구는 암컷 SD Rat에 구절초 추출물을 투여하고 방사선 전신 조사하여 생 체 내에서 방사선에 의한 손상으로부터 방호효과를 규명하 고자 한다.

Ⅱ. 대상 및 방법

1. 구절초 추출물 제조

경북 의성군 의성읍 도서리에서 재배되어 건조된 것을 그 린 약초에서 공급받아 사용하였다. 구절초의 보관은 직사광 선 및 습기 조절을 위해 냉동건조하여 보관하였다. 구절초 를 미세한 분말로 분쇄하였고, 전자저울로 35.78 g을 정량 하여 50% 농도 에탄올 1 L와 혼합하였다. 혼합한 시료를 Waterbath에서 시료 온도 70℃로 6시간 동안 추출하였 다[11-13]. 감압플라스크와 뷰흐너 깔때기, 여과지(Whatman Filterpaper, W.and R.Balston Ltd., UK)를 사용하여 여 과한 시료를 실험에 사용하였다.

2. 실험동물 관리 및 사육

실험동물에 관한 모든 절차는 인제대학교 동물실험윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 (승인번호 : 인제 2022-009호)하에 진행하 였다. 실험동물로는 암컷 SD Rat 4주령을 사용하였다. SD Rat은 인제대학교 동물자원센터 검역/순화실에서 1주간 검 역 및 순응 기간을 거친 후 Clean Room으로 옮겨 사육되었다. Clean Room의 사육 환경은 온도 20±2°C, 습도 55±5%, 조명 12 h/Day로 유지되었다. 실험군은 Table 1 과 같이 대 조군(NC), 구절초 추출물 투여군(DZ), 방사선 조사군(IR), 구절초 추출물 투여 후 조사군(DZ+IR) 총 4개의 군으로 편 성하였다. 구절초 추출물 투여는 검역/순화를 마친 후 2주 간 존대를 이용하여 1일 1회 2 cc(71.56 mg/day/250g) 투 여하였다. 방사선 조사 후 1일, 7일, 21일에 CBC test, SOD assay, 조직 병리학적 분석을 하였다.

3. 방사선 조사

선행연구에 따르면, 전리방사선 10 Gy를 조사하였을 때 Rat의 자궁 및 난소에서 명확한 방사선 손상을 볼 수 있었 다[14]. 따라서 SD Rat의 혈액 및 소장, 자궁에 손상을 입힐 수 있는 감마선 10 Gy를 SD Rat 전신에 조사하였다. 방사 선 조사는 한국원자력연구원 첨단방사선연구소에서 실시하 였다. 정확한 조사를 위해 SD Rat을 이동용 케이스(60.5 × 32.5 × 23 cm³, 종이)에 넣고 조사하였다. 조사 선원은 Fig. 1 Co-60(C-188, MDS Nordin, Canada)을 이용하였 다. 조사 방법은 Co-60 136 Ci로 40 cm 거리에서 57분간 전신 조사하여 SD Rat의 흡수선량이 총 10 Gy가 되게 하였다.

4. 혈액 채취 및 분석

혈액 시료는 방사선 조사 후 1일, 7일, 21일에 채취하였 다. 암컷 SD Rat에게 2% Isoflurane을 사용하여 마취하였 고, 복부를 절개하여 복강 내 대정맥에서 혈액 시료를 채취 하였다. 채취 혈액은 동물용 EDTA 0.5 cc Tube에 옮겨 담 고, 즉시 Coulter mixer로 응고를 방지하였다. 동물용 혈구 세포분석기 (Complete Blood Cell count, CBC, mindray BC-2800VET, China)를 이용하여 백혈구와 혈소판 수를 분석하였다. 통계적 유의성을 위해 각 군의 개체 별 얻어진 혈액 시료를 CBC test 3회 실시하여 평균값을 구하였다.

5. 혈액 내 항산화 활성 분석

혈액 내 항산화 활성 분석은 방사선 조사 7일 후 각 군별 SD Rat에서 채취된 혈액 시료를 가지고 Marklund 등 기법[15]과 SOD-kit (Dojindo Molecular Technologies, Japan) Protocol 을 응용하여 SOD (Superoxide Dismutase) 활성도 변화를 측정하였다. 혈액 시료를 차광 처리된 튜브에 옮겨 Heparin 1000U 0.05 ml 와 혼합한 후 원심분리기를 사용하여 10분 간 4℃에서 600 g로 분리하였다. 분리 후 혈장을 제거하고 시료와 생리식염수를 1:1로 희석하였다. 해당 과정을 2회 반복한 후 시료에 증류수 4 ml, Chloroform 0.6 ml, 99.9% Ethanol 1 ml를 혼합하였다. Shaker를 사용하여 시료를 15 분간 4 ℃에서 섞어주었다. 그 후 10분간 4℃에서 600 g로 원심분리하였다. 분리된 시료에서 혈장을 15 ml Conical Tube로 옮겨 담았다. Centrifuge tube에 분리된 혈장 0.1 ml, 증류수 0.7 ml, 0.25% Ethanol 0.7 ml를 담고 섞어주 었다. 만들어진 시료를 Dilution buffer를 이용하여 농도별 로 1, 1/5, 1/5², 1/5³, 1/5⁴, 1/5⁵, 1/5⁶가 되게 희석하였다. 그 후 96 well plate의 각 well에 농도별 시료와 Dilution buffer, Enzyme working solution을 각 20 ㎕와 WST solution 200 ㎕를 담았다. 만들어진 96 well plate를 Incubator에서 3 7℃로 20분간 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였 다(Eq. 1).

6. 소장 및 자궁 조직학적 분석

방사선 조사 후 1일, 7일, 21일에 암컷 SD Rat의 소장과 자궁을 채취하였다. 채취한 조직을 10% Formalin이 든 Conical tube에 보관하였다. 조직의 Paraffin block을 만들기 위해 70% Ethanol을 이용하여 조직을 탈수시킨 후 Xylene으로 치환하였다. 그 후 슬라이드로 분할하고, Hematoxylin and Eosin으로 염색하여 광학 현미경으로 조직의 변화를 분석하 였다.

7. 통계 처리 및 분석

실험 결과는 SPSS statistics 26 version을 이용하여 Student’s t-test 방법으로 분석하였다. 분석된 실험 결과 를 평균 ±표준편차(Mean±SD)로 표시하였다. p<0.05 수 준에서 각 군별로 유의성을 검정하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 혈액학적 관찰

암컷 SD Rat에게 방사선 조사 후 1 일차 백혈구 수치는 Table 2와 같이 IR 군과 DZ+IR 군에서 급격한 감소가 있었 으나, IR 군보다 DZ+IR 군 (p<0.05)에서 감소가 완화되었 다. 조사 후 21 일차 IR 군에서는 2.77±0.96 10³/μl로 기 준 범위(2.9-15.3 10³/μl)에 못 미치는 수치가 나왔으나, DZ+IR 군에서는 3.90±1.74 10³/μl 기준 범위 수준으로 회복되었다. 혈소판의 경우 7 일차에 Table 3과 같이 IR 군 과 DZ+IR 군의 수치가 급격히 감소하였으며, IR 군보다 DZ+IR 군(p<0.05)의 감소가 완화되었다.

2. 혈액 내 항산화 효소 활성 변화 관찰(SOD assay)

암컷 SD Rat 혈액 내 항산화 효소 활성도 변화를 보면 방 사선 조사 후 7일 경과 했을 때 Table 4와 같이 IR 군은 61.35±0.72 U/ml로 NC 군의 142.21±3.99 U/ml보다 절 반 정도로 감소하여 낮은 활성을 나타냈다. 이에 반해 DZ+IR 군은 145.77±1.66 U/ml (p<0.001)로 NC 군 항산 화 활성 수준으로 유의하게 높은 활성을 나타냈다.

3. 조직학적 관찰

방사선 조사 후 소장 융모 길이 변화와 자궁내막 조직의 변화를 관찰하였다. 방사선 조사 21일 후 소장 융모 길이 변 화 Fig. 2를 보면 DZ+IR 군은 NC 군 수준으로 회복되어 융 모들이 고르고 길었다. IR 군의 경우 소장 융모 길이가 일부 분만 회복되어 들쭉날쭉하고 평균 융모 길이가 NC 군에 비 해 짧았다. 방사선 조사 21일 후 자궁내막 조직의 변화 Fig. 3을 보면 DZ+IR 군은 NC 군 수준으로 자궁내막 두께가 두 툼해졌으며, 경계면이 뚜렷해졌고, 구불구불한 형태를 가졌 다. 이에 반해 IR 군의 자궁내막은 NC 군에 비해 얇고 경계 면이 흐렸으며, 매끈한 형태를 가졌다.

Ⅳ. 고 찰

본 연구에서는 구절초 추출물의 방사선 방호효과를 확인 하기 위하여 SD Rat에게 구절초 추출물을 경구 투여하였 다. 그 후 감마선 10 Gy를 SD Rat에게 전신 조사하여 1일, 7일, 21일 경과 후 혈액 내 혈구 수 변화와 항산화 활성 변 화(SOD Assay), 소장과 자궁의 조직 병리학적 분석하였다. 혈액 내 백혈구 수 변화를 보면 방사선 조사 후 1일 경과 했 을 때 IR 군과 DZ+IR 군은 NC 군보다 급격히 감소하였으 나, IR 군보다 DZ+IR 군 (P<0.05)에서 감소가 완화되었다. 이는 방사선에 민감한 백혈구가 방사선 조사 후 급격히 감 소하였으나 구절초 추출물의 항산화 효과로 인하여 DZ+IR 군에서 감소가 완화된 것으로 사료 된다. 또한, 방사선 조사 후 21일 경과 했을 때 IR 군은 2.77±0.96 10³/μl로 기준 범위(2.9-15.3 10³/μl)에 미치지 못하였으나, DZ+IR 군은 3.9±1.74 10³/μl로 기준 범위 수준으로 회복하였다. 혈소 판의 경우 방사선 조사 후 7일 경과 했을 때 IR 군과 DZ+IR 군이 급격한 감소를 하였으나, IR 군에 DZ+IR 군 (P<0.05) 에서 감소가 완화되었다. 이는 방사선에 민감한 혈구 세포 가 방사선 조사 후 급격히 감소하였으나 구절초 추출물의 항산화 성분이 자유라디칼을 소거하여 세포들의 손상을 막 은 것으로 사료 된다. 그 결과 DZ+IR 군이 IR 군보다 감소 가 완화되고 정상 수치로 회복된 것으로 보인다. 혈액 내 항 산화 활성 변화 분석 (SOD Assay)에서는 방사선 조사 후 7 일이 경과 했을 때 IR 군은 61.35±0.72 U/ml로 NC 군 142.21±3.99 U/ml의 절반 정도로 감소하여 낮은 활성을 보였다. 반면에 DZ+IR 군은 145.77±1.66 U/ml (P<0.001) 로 NC 군 항산화 활성 수준으로 유의하게 높은 활성을 나타 냈다. 이는 구절초 내 항산화 성분들이 혈액 내 항산화 효소 활성을 증가시킨 것으로 사료 된다. 소장 융모 길이 변화를 관찰한 결과 방사선 조사 후 21일 경과 했을 때 IR 군에서는 일부분 회복되어 소장 융모가 여전히 짧은 부분이 존재해 들쭉날쭉하고 평균 길이도 NC 군에 미치지 못하였다. 이에 반해 DZ+IR 군은 융모가 고르고 평균 길이도 NC 군 수준으 로 회복하였다. 이는 구절초에 함유된 클로로겐산의 성분이 소장에서 흡수되어 항염 및 항산화 작용을 통해 방사선 방 호효과를 보인 것으로 사료 된다. 또한, 자궁내막을 관찰한 결과 방사선 조사 후 21일 경과 했을 때 IR 군과 DZ+IR 군을 비교하면, IR 군의 자궁내막은 DZ+IR 군에 비해 얇 으며, 경계면이 흐릿하고 매끈한 형태를 가졌다. 반면에 DZ+IR 군은 자궁내막의 두께가 두툼하고, 경계면이 뚜렷하 며, 구불구불한 형태를 가졌다. 이는 구절초 추출물이 암컷 SD Rat 자궁에도 영향을 미쳐 NC 군 수준으로 회복된 것으 로 사료된다.

Ⅴ. 결 론

인체 내 방사선이 들어와 자유라디칼을 생성하고 이에 따 른 방사선 손상으로부터 구절초 추출물의 방사선 방호효과 를 확인하기 위해 암컷 SD Rat에 10 Gy Co-60 감마선을 조사하여 실험을 진행했다. DZ+IR 군과 IR 군을 비교하였 을 때 혈액 내 백혈구와 혈소판에서 감소가 완화되고 기준 범위 수준으로 회복을 돕는 것을 확인했다. 또한, 혈액 내 항산화 효소 활성 역시 DZ+IR 군이 IR 군보다 항산화 효소 활성이 증가하는 것을 확인했다. 소장 융모 길이 변화와 자 궁내막 조직의 변화를 비교해 보았을 때 IR 군은 일부 회복 한 것에 반해 DZ+IR 군은 NC 군 수준으로 회복한 것을 확 인했다. 따라서 본 연구는 구절초 추출물이 방사선 손상으 로부터 방호효과 및 회복에 도움이 되는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 천연 방사선 방호제 물질 연구에 유용한 기 초 자료로써 활용할 수 있을 것으로 기대된다.