Ⅰ.서 론

Candida albicans(이하, C. albicans)는 정상인의 경우 소화기관이나 질 점막 및 피부 등에서 나타나는 가장 흔한 병원성균주로 인체의 정상세균총으로 Candida 속중 가장 독성이 강한 균종으로 알려져 왔다. 또한 면역억제제 복용, 스테로이드나 항생제 남용, 비타민 결핍증, 만성소모성질 병, 후천성면역결핍 증후군환자들에서 자주 발견이 된다¹⁾.

칸디다증(candidiasis)은 피부, 점막, 신장 등에서 급성 혹은 만성으로 발병하며, 사망률이 약 30%정도이며, 칸디 다 감염 시 의학적 처치 방법은 화학치료제(amphotericin B, azole drug)를 이용하지만, 독성과 약품 내성이 문제 시 되어 왔다²⁾.

칸디다증은 이스트 같은 진균, 칸디다(candidia)는 정상 적으로 입, 피부, 소화기계, 질 발육과도 시 나타나며, 입의 감염(thrush, 아구창), 소화기계와 피부감염의 원인이 된 다.

C. albicans를 포함한 급성 염증반응의 경우 흡입, 발열, 반점, 통증, 기능 상실 등이 유발 되는데, 이는 조직 내 백혈 구와 혈장 내로 침윤되기 때문이다³⁾. C. albicans은 사람과 동물의 급성 및 만성전신 감염 중에서 가장 흔히 발견되며, 생체의 생리기능상 신장감염이 용이하여 신장 칸디다증을 유발하고, 특히 신장 이식한 경우에는 심각한 합병증과 함 께 사망을 유발시키는 요인으로도 많이 알려져 있다.⁴⁾

산화질소(Nitric oxide)는 NO synthase (NOS)라는 효소 에 의해 합성이 이루어지는데, 산소와 NADPH 존재 하에서 L-arginine이 L-citrulline과 NO로 전환되면서 생성되어 지는 물질이다. NO는 크게 세 가지 효소로 나누어지는 데, neural (nNOS), endothelia (eNOS)와 사이토카인 혹 은 염증 반응, 혹은 외부 자극(lipopolysaccharide, 혹은 interferon-gamma)등에 의해 유도 되어지는 inducible NOS (iNOS) 등이 있다. 그 중에서 iNOS가 염증 반응에 관 여한다. nNOS와 eNOS는 항상 발현되어 있으며, iNOS의 경우 Interferon-gamma, lipopolysaccharide (LPS), 그 리고 여러 가지 염증성 사이토카인 (IL-1β, TNF-α)의 자극 이 있을 때 발현된다. 보통 eNOS는 강력한 혈관확장제로서 혈관의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다⁵⁾.

사이토카인은 림포카인으로 인체의 대식세포, 림프구, 호 중구, 섬유아세포, vascular endothelial cells 등의 다양한 세포 내에서 분비되어 신체내의 염증 작용, 조혈 작용 및 대 사에 관여하는 물질로, 인터루킨(IL), 표피성장인자(EGF), 세포독성인자, 활성 또는 저해인자, 콜로닉자극인자, 종양 괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론(IFN), erythropoietin, 혈소판유래 증식인자(PDGF) 등의 다양한 종류가 알려져 있 다^6,7).

Squalene (이하, SQ라 함)는 트리테르펜 6개의 이중결합 을 가지며, β-carotene과 구조적으로 유사하고, 콜레스테 롤 합성에 관여하는 중간 대사산물로서 60～85%가 dietary SQ 형태로 흡수된다. SQ는 올리브 유, 0.2～0.7%가 함유 되어 있고, 인간 음식물의 지방 와 기름에는 0.002～0.03% 가 함유 되어져 있다.

SQ는 올리브 유, 야자 유, 밀 유, 아마란스 종실유, 쌀겨 유 등 매우 광범위한 형태로 분포하며, 인체 지방에서의 대 사 연구를 통해 80%가 중간대사물질, 20%는 미소체 막 결 합 형태로 함유되어져 있다⁸⁾. 구강을 통해 스쿠알렌을 흡수 하게 되면 plant sterol의 hepatic & serum level이 감소되 어지고⁹⁾ SQ는 고효율 활성산소 분해제¹⁰⁾ 암에 대한 화학적 방어효과¹¹⁾ 그리고 항 종양효과¹²⁾가 있음이 알려져 왔다.

스쿠알렌이 염증반응에 미치는 영향의 실험연구는 아직 까지는 없는 실정이다. 그래서 연구의 필요성이 제기되어 연구를 시도하게 되었다.

본 연구의 목적은 Candida 속 진균 중에서도 피부, 구강 및 질 점막에 기생하고 있다가 숙주동물의 저항력을 약화시 키는 수술 및 다른 질병으로 인하여 항균제 및 steroid제 면 역억제제 등을 오랫동안 사용하여 비정상적인 신체로 인해 면역기능이 저하되어 기회감염(opportunistic infection)을 일으킨다.

병원성이 강하고 가장 빈번히 동물에 질병을 유발시키는 C. albicans-유도 염증반응에 대해 생쥐를 이용한 생체 내 실험을 통해 C. albicans에 의해 유도 되어지는 염증반응 억제에 대한 스쿠알렌의 처치가 염증반응을 경감시키는지 여부를 알아보고자 하였다.

Ⅱ.재료 및 방법

1.재료

1)실험시약

본 실험에 사용한 시약은 Squalene (SQ)는 (주)세모(순도 99%이상), Sodium nitrate (Sigma, USA), sulfanilamide (Sigma, USA), Tris (Bio Basic, 미국)Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA, Sigma, USA), Sodium chloride (NaCl, Junsei, Japan), Triton-X 100 (Junsei, Japan), Sodium nitrate (Sigma, USA), TNF-α, IL-6에 대한 단 클론항체(monoclonal antibody)의 ELISA Kits(R&D systems, MIN, USA)는 Bioneer (Daejeon, Korea)에서 구 입하여 사용하였다

2)공시균주

C. albicans NIH A-207은 전남대학교 생화학교실(광 주, 한국)로부터 공급받아 Sabouraud dextrose broth (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD)에서 교 반을 하면서 28°C에서 배양하였다. 24시간 동안 배양 후 세포들은 2,000 × g에서 원심 분리하여 수확하였고, PBS 로 3회 세척하였으며, 필요한 농도(1×10⁵/㎖)로 희석하여 사용하였다.

3)실험동물

본 실험에 사용한 실험동물은 다물 실험동물센터 (대전, 한국)에서 생산, 공급하고 있는 ICR계 생쥐 (체중 25-35 g) 를 사용하였다. 생쥐는 23±2℃, 습도는 45±5%로 유지된 사육실에서 폴리카보네이트로 제작된 사육장 (40×25×17 ㎝)에서 사육하였으며, 사료 (제일제당 제품)와 급수는 자유 롭게 섭취하도록 하였다.

2.방법

1)실험군 설정(In vivo)

SQ (80㎖/㎏)와 C. albicans (2×10⁶/㎏)는 ICR계 생쥐 의 복강에 주입하였다. 실험군는 다음과 같다. 실험군 1은 대조군, 실험군 2는 C. albicans만 투여한 군(1, 3일째), 실 험군 3은 SQ (80㎖/㎏)를 7일간 복강투여(1일 1회)한 후, C. albicans를 투여한 군(1일, 3일째), 실험군 4는 SQ (80㎖/ ㎏)를 3일간 복강투여(1일 1회)한 후, C. albicans를 투여한 군(1일, 3일째), 실험군 5는 C. albicans를 투여한 후 SQ (80㎖/㎏)를 투여한 군(1일, 3일째)으로 각 실험군별, 생쥐 7마리씩을 사용하였다(Table 1).

2)NO (Nitric oxide)측정

신장 조직에서 생성된 NO의 양은 NO₂^-의 형태로서 Griess시약을 이용하여 측정하였다. 상층액을 96 well plates에 각 분주한 후 Griessreagent (0.8% sulfanilamide/ 0.75% N-(naphthyethylene)diamine in 0.5N HCl, Sigma) 100㎕를 첨가하였다. 15분간 실온에서 방치한 후, 540nm 파장에서 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 nitrite 농도를 측정하 였다. 이 때 Sodium nitrate (0.5～100M)를 nitrite 표준으 로 이용하였다.

3)C. albicans-유도 사이토카인의 측정

TNF-α, IL-6 등의 사이토카인의 측정 방법은 Bioneer 회사의 메뉴얼에 따랐다. 50㎕ 분석 희석액(assay diluent) 을 제공된 well에 각각 넣고, 각 사이토카인에 대한 표준용 액과 실험액을 각각 50㎕씩 well의 중심부에 첨가하여 잘 섞이도록 plate를 가볍게 바닥에 흔든 다음 제공된 밀폐용 테이프로 덮어 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 밀폐용 테 이프를 제거하고 제공된 washing buffer로 5회 세척 과정 을 반복하였다. 측정하고자 하는 사이토카인의 conjugate 용액 100㎕를 각 well에 넣고 밀폐용 테이프로 덮어 2시간 동안 반응시킨 후, washing buffer로 5회 세척 과정을 반복 하였다. 100㎕ 기질용액을 각 well에 넣고 30분 동안 실온 에서 차광상태로 보관하면서 반응시켰다. 그 후, 정지 용액 을 각 well에 100㎕씩 넣고 30분 이내에 세포배양액에 분비 되어 kit내 반응시약과 반응한 TNF-α, IL-6 분비량을 각 각 측정하였다(microplate reader:450㎚, wavelength correction:570㎚, USA).

4)통계학적 분석

각 실험군별 통계학적 유의성은 개인용 컴퓨터 통계프로 그램인 Statisitcal Analsis System (SAS)를 이용한 ANOVA test에 의하여 검정하였고, 각 p값은 0.05 미만의 것을 유의한 수준으로 고려하였다.

Ⅲ.결 과

1.C. albicans-유도 NO 생산에 대한 SQ 효과

생쥐에 C. albicans를 감염(복강투여, 2×10⁶/㎏)시킨 후, NO 생성량을 신장 조직을 통해 1일, 3일째 경과 후 관찰하 였다. SQ (80㎖/㎏)를 7일간 1일 1회 pre-treated(복강 투 여)한 다음, C. albicans를 감염시킨 군에서 1, 3일째 모두 신장 조직 내에서의 NO 생산량을 감소시키는 것을 관찰할 수 있었다(p < 0.05)(Fig. 1). 그러나 선처치 기간이 짧은 3 일군과 C. albicans 처치 후에 SQ를 처치한 군에서는 C. albicans-유도 NO 생성량이 감소되지 않음을 관찰할 수 있 었다.

2.C. albicans-유도 TNF-α 생산에 대한 SQ 효과

생쥐에 C. albicans를 감염(복강투여, 2×10⁶/㎏)시 킨 후, TNF-α 생성량을 신장 조직을 통해 감염 후 1일, 3 일 경과 후 관찰하였다. SQ (80㎖/㎏)를 7일간 1일 1회 pre-treated(복강투여)한 다음, C. albicans를 감염시킨 군에서 3일째 군에서만 신장 조직 내에서의 TNF-α 생성량 을 감소시키는 것을 관찰할 수 있었다(p < 0.05)(Fig. 2).

3.C. albicans-유도 IL-6 생산에 대한 SQ 효과

생쥐에 C. albicans를 감염(복강투여, 2×10⁶/㎏)시킨 후, IL-6 생성량을 신장 조직을 통해 오염 후 1일, 3일 경과 후 관찰하였다. SQ (80㎖/㎏)를 7일간 1일 1회 pre-treated (복강투여)한 다음, C. albicans를 감염 시킨 군에서 3일째 군에서만 신장 조직 내에서의 IL-6 생성량을 감소시키는 것을 관찰할 수 있었다(p < 0.05)(Fig. 3).

Ⅳ.고 찰

본 연구에서는 Candida 속 진균 중에서도 피부, 구강 및 질의 점막에 기생하고 있다가 숙주 동물의 저항력을 약화시 키는 영양장애, 만성소모성질병, 수술 및 다른 질병으로 인하 여 항균제 및 steroid제, 면역억제제 등을 오랫동안 사용하여 면역기능이 저하되어 기회감염(opportunistic infection) 을 일으킨다. 따라서 병원성이 강하고, 가장 빈번히 질병 을 유발시키는 C. albicans-유도염증 반응에 대해 mouse kidney tissue를 스쿠알렌을 이용한 in vivo 실험을 통해 C. albicans-유도 급성 염증반응을 경감시키는 것을 관찰 하였다. 본 연구를 위해 선행연구를 살펴보았다.

RAW 264.7 cells에서 차가 버섯 에탄올 추출물의 경우 LPS로 유도된 IL-1β, IL-6의 분비를 유의성 있게 증가시 키며, LPS는 IL-1β, IL-6의 (3, 10, 30, 100㎍/㎖)농도를 의존적으로 유의성 있게 감소되고, 차가추출물은 IL-1β, IL-6의 pro-infiammatory cytokine을 억제 시킨다¹³⁾. 본 연구결과에서 SQ (80㎖/㎏)를 7일간 1일 1회 pre-treated (복강투여)한 다음, C. albicans를 감염 시킨 군에서 3일째 군에서만 신장 조직 내에서의 IL-6 생성량을 감소시키는 것을 관찰할 수 있었다(p < 0.05). 따라서 본 연구 결과와 같 았다.

생쥐 대식 세포주에 당귀, 어성초, 오가피, 황기 등의 한 약재추출물을 IFN-gamma와 처치하면 NO와 TNF-α 생산 은 IFN-gamma와 추출물 농도에 의존적으로 유도되어지 고, LPS를 단독으로 처치한 경우 NO 농도가 증가하지만, 오가피를 같이 처치한 경우는 NO 농도가 감소되어진다. 하 지만 한약재 추출물을 단독 처치한 경우에는 사이토카인의 생산에는 영향을 주지 못 한다¹⁴⁾.

본 연구에서도 C. albicans를 감염시킨 군에서 1, 3일째 모두 신장 조직 내에서의 NO 생산량을 감소시키는 것을 관 찰할 수 있었는데, 오가피를 처치한 경우에 NO 농도가 감소 한다는 것과 결과와 같았다.

C. albicans에 천연무독성 착화제인 키토산을 일정 농도 처치하면, C. albicans에 대하여 apoptosis를 유발시키다 가 시간이 경과함에 따라 괴사가 진행 되고, 또한, 항균 활 성도가 강함이 보고되었다¹⁵⁾.

선행연구에서 수용성 키토산을 세포배양을 할 때 자극원 (stimulators)보다 먼저 선처치(pre-feeding)하면 TNF-α, IL-6등의 생산량 및 iNOS 발현량을 감소시킨다¹⁶⁾. 본 연구 의 결과에서 SQ (80㎖/㎏)를 7일간 1일 1회 pre-treated (복강투여)한 다음, C. albicans를 감염시킨 군에서 3일째 군에서만 신장 조직 내에서의 TNF-α 생성량을 감소시키는 것을 관찰할 수 있었다(p < 0.05)

본 실험에서도 스쿠알렌을 실험동물인 생쥐에 C. albicans 감염 7일 전에 처치한 in vivo 실험에서 염증반응 인자들의 감소 결과를 관찰하였는데, 결과는 같았다. 하지만 C. albicans 감염 후에 SQ를 처치한 후처치(post-treatment groups)의 경우에는 모두 별 효과가 없음이 관찰되었다.

본 연구를 통해서 C. albicans는 신장조직에 급성염증 반 응을 유도하는 것을 알 수 있었다. 하지만 C. albicans-유 도 급성 염증반응에 대해 스쿠알렌의 처치가 농도 및 투여 방식에 따라 염증반응 정도를 억제시키는 것을 실험으로 알 수 있었다.

결론적으로, 본 연구를 통해 스쿠알렌이 예방적 측면에서 C. albicans-유도 면역억제에 대해 회복 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다.

최종적으로 향후에는 in vitro 실험과 같은 다양한 연구 가 이루어져야 할 것이다.

Ⅴ.결 론

본 연구에서는 Candida albicans로 유도한 염증반응에 대해 Squalene의 처치를 통해 염증반응을 경감시키는가에 대해 확인하였다.

실험동물은 (ICR계 생쥐) 각 실험군별 7 마리씩을 사용하 여 in vivo로 실험을 하였다. C. albicans-유도 염증인자 중 TNF-α, IL-6, NO는 ELISA kits 방법을 이용하여 관찰 하였다. 실험을 통해 다음과 같은 결론을 얻었다.

결론적으로 Squalene이 C. albicans-유도 염증인자들의 억제를 위해서는 예방적 차원에서 SQ를 공급하는 것이 효 과가 있음을 알 수 있었다. 따라서 SQ 처치가 C. albicans- 유도 면역억제에 대해 회복 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다.