Ⅰ. 서 론
방사선은 현대사회에서 의학 및 산업 등 다양한 분야에서 사용된다. 의료, 산업, 연구, 교육, 공공기관 등 다양한 분야에서 방사선 이용이 증가되어 방사성동위원소등을 이용하는 기관이 점차 늘어나는 중이다. 또한 방사선 이용 증가로 인해 국내뿐만 아니라 세계의 방사선 시장이 꾸준히 성장 추세에 있다. 특히 의료분야의 치료 및 진단에서 방사선은 대체 불가능한 기술로 자리 잡아 수준 높은 의료 서비스 제공의 선두에 있다[1-2].
하지만 방사선의 사용에는 잇따르는 위험성이 크다. 방사선 피폭은 동물이나 사람의 모든 기관에 기능장해를 유발할 수 있다. ICRP (국제방사선 방호위원회)에 의해 정의된 연간 100 mSV 이상의 고선량 방사선에 피폭된다면 조혈기능 장해, 중추 신경 장해, 홍반, 탈모, 불임 등 결정적 영향이 나타난다. 그리고 연간 100 mSV 미만의 저선량 방사선에 피폭된다면 암, 유전적 돌연변이, 수명단축 등 확률적인 영향의 발생 확률이 높아 진다[3]. 이를 방지하기 위해 화학적 방사선방호제가 사용되고 있지만 이는 자체적으로 독성을 띄어 사용에 주의가 필요하다 [4]. 따라서 부작용 및 독성이 적고, 자유라디칼들을 소거할 수 있는 천연물 유래 방사선 방호제에 대한 연구가 필수적이다[5]. 천연물에 함유된 물질 중 체내에서 자유라디칼을 소거하는 역할을 할 수 있는 물질을 항산화 물질이라고 한다. 항산화 물질은 방사선으로 인해 발생한 자유라디칼을 소거하여 자유라디칼이 체내 분자를 손상하지 못하도록 방호하는 역할을 한다[6].
본 연구에서는 홍삼, 삼백초, 복분자를 혼합한 혼합물로 방사선 방호 및 회복 효과를 확인하고자 한다. 홍삼은 대표적인 건강기능식품으로 홍삼 특유의 사포닌(Saponin)을 함유하는데 이는 구리/아연-과산화물제거효소(Cu/Zn-SOD), 글루타티온 환원효소(GSH reductase), 과산화수소분해효소(Catalase), 비단백질-티올(nonprotein-SH)의 활성을 증가시킨다고 알려져 있다[7]. 또한 항산화 효과가 뛰어난 말톨(Maltol), 바닐산(Vanillic acid), 살리실산(Salicylic acid), 신남산(Cinnamic acid)등 페놀 화합물을 가진다[8]. 삼백초는 플라보노이드(Flavonoid)의 일종인 퀘르세틴(Quercetin), 이소퀘르시트린(Isoquercitrin), 루틴(Rutin), 타닌(Tannin)등을 주성분으로 가지며 항산화 및 향균 효과로 산화적 스트레스 소거 및 활성산소 제거효과를 가진다[9-10]. 복분자에는 페놀산(Phenolic acid), 플라보노이드(Flavonoid), 안토시아닌(Anthocyanin), 갈산(Gallic acid)등과 같은 페놀 화합물이 함유되어 항산화, 항암 및 면역증진 등의 효능을 가진다[11]. 이처럼 각각의 천연물에 많은 항산화 성분이 포함되어 있는데, 최면 외 5명의 선행연구에 따르면, 홍삼(Red Ginseng) 단독 추출물보다 삼백초(Saururus chinensis (Lour.) Baill.), 복분자(Rubus coreanus Miq.)를 혼합하여 급여하였을 때 항산화 효소계 활성에서 상승효과가 나타난 것을 확인하였다[12]. 이를 기반으로 본 연구에서는 흰 쥐(SD Rat)에서 홍삼, 삼백초, 복분자 혼합 추출물의 방사선 방호 및 회복 효과를 알아보고자 한다. 흰 쥐(SD Rat)에 홍삼, 삼백초, 복분자 혼합 추출물을 2주간 경구 투여한 후 6 Gy(Gray) 감마선을 조사하여 생리 변화를 관찰하려 한다. 본 연구는 혈액학적 관찰, 항산화 활성 효소 변화, 조직학적 관찰을 통해 홍삼, 삼백초, 복분자의 방사선 방호 및 회복 효과를 확인하고자 한다.
Ⅱ. 대상 및 방법
1. 홍삼, 삼백초, 복분자 혼합 추출물
실험에 사용된 재료는 국내산 원료 100% 분말로 홍삼과 복분자는 농업회사법인푸른산(주), 삼백초는 ㈜에코케이션에서 공급받아 이용하였다. 분말화된 홍삼, 삼백초, 복분자를 4.998 g, 8.33 g, 4.998 g로 정량하여 조합한 후 60% 에탄올 1 L과 혼합하여 항온수조에서 90℃로 6시간동안 중탕하였다. 분말의 비율, 에탄올 추출물의 농도 및 환경은 선행논문을 참고하여 채택하였다[12]. 본 농도의 홍삼, 삼백초, 복분자 혼합 추출물은 홍삼 단독 추출물을 경구 투여한 군에 비해 항산화 활성 효소(Superoxide dismutase), 과산화수소분해효소(Catalase) 등 4가지의 항산화 효소에서 약 9.5% 높은 효소활성을 보였다. 이에 의해 홍삼 단독 추출물보다 혼합 추출물이 항산화계 활성에 상승효과를 가져온다고 시사되었다. 추출한 혼합 추출물은 여과지를 사용하여 3회 감압 여과한 후 실험에 사용하였다.
2. 실험동물 사육
하나바이오에서 4주령 수컷 흰 쥐(SD Rat) 96마리를 구입하여 실험에 사용하였다. 실험동물에 관련된 모든 실험과정은 인제 대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인(승인번호 : 인제 2023-020호) 아래에 진행하였다. 흰 쥐(SD Rat)는 조명 12시간/Day, 실내 온도 18~22℃, 습도 50~60%로 유지되는 인제대학교 내에 위치한 동물자원센터의 무균실에서 사육하였다. 사육 기간 동안 표준사료와 탈 이온수를 매일 1회 공급하여 자유급식을 진행하였다. 흰 쥐(SD Rat) 구매 직후 1주일간 검역 및 순화기간을 거친 후 4개의 실험군으로 편성하였다. 일반대조군(NC군), 혼합 추출물 투여군(RSR군), 6 Gy 방사선 조사군(IR군), 혼합 추출물 투여 후 방사선 조사군(RSR + IR군)으로 구성하고 시간에 따른 변화를 관찰하기 위해 각 군마다 1, 7, 21일차로 나누어 편성하였다. 4개의 군 중에 RSR군, RSR+IR군은 경구를 통해 위내 직접투여 가 가능한 존대를 이용하여 2주간 매일 동일한 시간에 1회 2 cc (36.6 mg/ Day/ 250 g)의 추출물을 경구 투여하였다.
3. 방사선 조사
흰 쥐(SD Rat)의 방사선 조사는 한국원자력연구원 첨단방사선 연구소(Jeongeup-si, Jeollabuk-do, KR)에서 보유중인 Co-60 (C-188, MDS Nordion, Canada) 방사선원을 이용하여 진행하였다. 선량 선정 이유로는 방사선으로 소장에 장애를 유발하는 최소 선량이 6 Gy인 것을 참고하였다[13]. 방사선에 의한 혈액학적, 조직학적 변화는 나타나지만 윤리적으로 가장 적은 선량이라 판단하여 6 Gy를 조사하였다. 실험동물을 원활하게 이동시키기 위해 60.5×32.5×23 cm3의 이동용 종이 박스를 사용하였고 3 Gy/h의 선량률로 80.01 cm의 거리에서 120분간 조사하였다. 조사 시간과 거리는 방사선 조사선량 및 방사선량에 의거하여 한국원자력연구원의 자체적인 계산식으로 산출되었으며 흰 쥐(SD Rat)는 총 6 Gy의 흡수선량을 가진다(Eq. 1).
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R : Baseline Dose Rat (mGy/h)
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D : Distance (cm)
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λ : Decay Constant of Co-60
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t : Number of days since measurement
4. 시료 채취
시간에 따른 변화를 관찰하기 위해 방사선 조사 후 1, 7, 21 일차에 흰 쥐(SD Rat) 해부를 실시하였다. 이산화질소 : 산소 (8 : 2)와 3% 아이소플루레인(Isoflurane)을 혼합 후 흡입시켜 마취하였다. 복부를 절개하여 복강 대정맥에서 혈액학적 관찰을 위한 전혈을 채취하였다. 그리고 조직학적 관찰을 위한 소장, 전립선을 채취하여 10% 포르말린에 고정하고 조직처리과정, H&E염색을 거쳐 조직 슬라이드를 제조하였다.
5. 혈액학적 관찰
흰 쥐(SD Rat)에서 채취한 혈액은 Heparin lithium이 처리 되어있는 0.5 cc 채혈용 EDTA Tube에 담은 후 Coulter mixer 를 이용하여 혼합함으로 혈액응고를 방지하였다. 그리고 동물용 혈구 세포 분석기(Complete Blood Cell Count, Mindray BC-2800vet)를 사용하여 백혈구(White Blood Cell)와 혈소판(Platelet)의 혈구 변화를 분석하였다. 각 개체의 혈액시료는 3회 반복 측정하여 평균값을 사용하였다.
6. 항산화 활성 효소(Superoxide dismutase) 측정
항산화 활성 효소(SOD)는 방사선에 의하여 발생된 자유라디칼을 소거하는 효소이다. 자유라디칼이 항산화 활성 효소의 기작에 의해 제거되면 세포의 산화 및 손상이 감소된다[10,14].
혈액 내 항산화 활성 효소의 분석은 SOD assay kit (Dojindo Molecular Technologies, Japan)를 사용하여 Protocol과 Marklund 등[15-16]의 방법을 응용하여 실행하였다. 채취한 혈액은 헤파린 1000 U 0.05 ml와 혼합하여 차광한 상태에서 4℃의 온도로 10분간 600 g로 원심 분리하였다. 분리된 혈장을 제거하여 식염수와 1 : 1로 희석하며 위의 과정을 2번 반복 하였다. 다음 증류수 4 ml, 클로로포름 0.6 ml, 99.9% 에탄올 1 ml를 첨가하여 Shaker를 이용해 4℃에서 15분간 교반하고 추가로 10분간 600 g로 원심 분리하였다. 상층의 혈장을 15 ml Conical tube에 0.1 ml 옮겨 담고 증류수 0.7 ml, 0.25%에 탄올 0.7 ml를 추가하여 혼합하였다. 위의 시료를 농도 1 Sample solution으로 지정하여 Dilution buffer를 이용해 1/5의 농도로 6회 계단희석하여 1/56까지 7개의 Sample을 제조하였다. 96 Well plate에 7개의 Sample, Dilution buffer, Enzyme working solution을 각각 20 μL씩 투여하고 WST solution : Buffer solution (1 : 18)을 혼합한 WST working solution을 200 μL 추가하여 37℃ 배양기에서 20분 동안 반응시켰다. ELISA Reader (Biotek, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하고 아래의 식을 이용하여 SOD activity (%)를 도출하였다(Eq. 2).
7. 조직학적 관찰
조직학적 분석을 위해 소장, 전립선을 채취하여 10% 포르말 린에 고정하였다. 점진적 고농도의 에탄올을 사용하여 탈수과정 후 자일렌을 이용하여 투명, 침투, 포매과정을 진행해 조직을 포함한 Block을 만들었다. 박절기(Microtome)를 이용하여 Block을 얇게 박절하고 그 절편을 Slide에 부착하여 H&E염색을 실시하였다. 염색한 Slide는 광학현미경을 이용하여 관찰하였다. 조직학적 영향은 혈액에 비해 천천히 나타나기 때문에 7일차부터 분석을 실행하였다.
8. 통계학적 분석
SPSS statistics 26 version프로그램을 통해 Student’s t-test방법으로 실험 결과를 분석하였다. 평균 ± 표준편차 (Mean ± SD)로 표시하며 각 실험군마다 p<0.05 수준으로 통계적 유의성을 판명하였다.
Ⅲ. 결 과
1. 혈액학적 관찰
1) 백혈구(White blood cell)
방사선 조사 후 백혈구의 혈액학적 변화는 Table 2와 같다. 1일차에 IR군과 RSR+IR군의 수치가 급격히 감소하였으나 7, 21일차에는 IR군에 비해 RSR+IR군(p<0.05)의 백혈구 수치가 약 28%만큼 높아 유의미하게 증가하였다.
2) 혈소판(Platelet)
방사선 조사 후 혈소판의 혈액학적 변화는 Table 3과 같다. 조사 후 7일차에 IR군과 비교하여 RSR+IR군의 수치 감소가 덜하였다. 21일차에는 RSR+IR군의 수치가 NC군을 능가할 만큼 증가하였으며 이는 IR군에 비해 대략 44%만큼 높은 수치다.
2. 항산화 활성 효소(Superoxide dismutase) 측정
방사선 조사 후 21일차의 항산화 활성 효소 수치는 Table 4 와 같다. NC군과 비교하여 RSR군은 약 42.8%만큼 증가한 활성도를 나타내었다. 이에 비해 IR군은 약 31.5%만큼 낮은 수치로 크게 감소한 반면 RSR+IR군은 NC군과 유사한 수치를 나타내었다.
3. 조직학적 관찰
1) 소장
방사선 조사 후 7, 21일차의 소장 조직은 각 군마다 비슷한 양상을 보이며 대표 사진은 Fig. 1과 같다. 각 군별로 소장 융모 길이를 측정하고 평균하여 Table 5에 나타내었다. 7일차에서 NC군, RSR군에 비해 IR군, RSR+IR군의 소장 융모 길이가 짧아졌지만 RSR+IR군의 감소폭이 더 적었다. IR군에 비해 RSR+IR군의 융모 길이는 7일차에 약 10%, 21일차에는 약 5% 더 긴 것을 확인할 수 있다. 또한 소장 움의 배열과 소장을 구성하는 각 세포층의 경계가 뚜렷하게 회복되는 양상을 보여 더 조밀하게 구성하고 있다.
2) 전립선
방사선 조사 후 7, 21일차의 전립선 조직은 각 군마다 비슷한 양상을 보이며 대표 사진은 Fig. 2와 같다. 7일차 IR군은 세포 손상이 커 핵의 응축이 관찰된다. 또한 내강분비세포의 세포질이 유실되고 전립샘의 간격이 불균등하다. 이에 비해 RSR+IR군은 세포손상이 덜 하고 전립샘의 형태 또한 일정하다. 21일차에서 IR군의 세포손상은 부분적으로 관찰되나 RSR+IR군은 더 많은 회복을 보여 세포 배열과 전립샘 간격이 일정한 것을 확인하였다.
Ⅳ. 고 찰
방사선에 피폭되어 체내에 흡수되면 물과 반응하여 인체에 유해한 자유라디칼이 생성된다. 생성된 자유라디칼은 매우 불안정한 상태로, 반응성이 강하여 단백질, 당, 지질, DNA와 같은 인체의 세포 구성성분과 상호작용하여 손상을 입힌다. 방사선에 의해 발생된 자유라디칼에는 Superoxide radical anion (∙O2-), Hydroxyl radicals (∙OH), Hydrogen peroxide (H2O2) 등이 있으며 불안정한 산소화합물로 체내에서 생물학적 유해를 일으킨다. 이러한 손상을 최소화하기 위하여 체내 자유라디칼을 소거하고 세포 손상을 방지 및 감소시키는 것을 항산화 작용이라고 한다. 홍삼, 삼백초, 복분자 혼합 추출물에 포함된 다양한 항산화 성분과 항산화 효소계 활성 상승효과는 자유라디칼에 의해 발생되는 질병을 예방할 수 있다. 따라서 방사선 피폭에 의한 피해를 최소화하기 위하여 방사선 방호 및 회복에 대한 연구가 필수적이고, 특히 부작용 및 독성이 적은 천연 방사선 방호제에 대한 연구가 필요하다.
본 연구에서는 홍삼, 삼백초, 복분자 혼합 추출물의 방사선 방호 및 회복 효과를 확인하고자 NC군, IR군, RSR군, IR+RSR군 4개로 구분하였다. RSR군, IR+RSR군에는 혼합 추출물을 2주 간 경구 투여하였다. 경구 투여가 마치고 IR군, IR+RSR군은 6 Gy의 감마선을 전신 조사 하였다. 방사선 조사 후 시간경과에 따른 군별 혈액학적 변화, 항산화 활성 효소, 조직학적 변화를 분석하였다.
혈액학적 변화 중 1일차 백혈구에서 IR군, IR+RSR군은 NC 군과 비교하여 매우 감소된 수치를 보였다. 하지만 7, 21일차에서 RSR+IR군은 더 큰 회복세를 보이며 IR군에 비하여 약 28% 만큼 높았다. IR군, IR+RSR군의 혈소판은 7일차에서 큰 감소를 확인할 수 있었다. 하지만 IR군에 비하여 IR+RSR군의 감소가 더 적고 21일차에서 약 44% 만큼 높은 수치를 보여 혼합 추출물이 회복하는 과정에서 도움을 준 것을 확인하였다.
항산화 활성 효소의 수치를 비교해 본 결과, 홍삼, 삼백초, 복분자 혼합 추출물을 투여한 군에서 더 높은 활성도를 보였다. RSR군은 NC군에 비하여 약 42.8%, IR+RSR군은 IR군에 비하여 약 40.7% 높은 활성을 보였다. 이는 혼합 추출물이 항산화 효소계 활성에 기여하여 더 높은 항산화 방어기작을 나타낸 것으로 확인된다.
소장 융모는 소화된 영양분을 흡수하는 중요 구조물이다. 방사선 조사 후 7일차에서 IR+RSR군의 소장 융모 길이와 세포 손상에 의한 소장 내부의 형태변화가 적은 것을 확인할 수 있다. 그리고 21일차에는 더 빠른 회복세로 소장 융모의 길이가 더 길며 NC군과 유사한 형태까지 회복한 것을 확인하였다. 전립선을 보면 7일차의 IR군에서 세포 손상이 커 세포 간의 경계가 불명확하여 전립샘의 형태가 일정하지 않다. 하지만 IR+RSR군은 세포막의 손상이 없어 전립샘의 형태가 유지되어 있는 것을 확인할 수 있다. 21일차에 IR군은 전립샘비대증의 증상 중 하나인 내강분비세포의 과형성이 보이는 반면, IR+RSR군은 NC 군과 유사한 수준까지 회복된 것을 보아 조직학적으로 홍삼, 삼백초, 복분자 혼합 추출물은 방사선에 의한 손상을 방호하고 회복에 도움이 되는 것을 확인하였다.
위의 결과를 종합하여 보면 홍삼, 삼백초, 복분자는 각각 물질에 함유된 항산화 성분이 혼합되었을 때 상승된 항산화 효소계 활성효과를 보인다. 이는 방사선에 의한 손상을 방지하고 회복에 도움을 주는 것으로 확인된다.
Ⅴ. 결 론
본 연구에서는 홍삼, 삼백초, 복분자 혼합 추출물의 방사선 방호 및 회복 효과를 확인하기 위해 혼합 추출물을 수컷 흰 쥐(SD Rat)에 경구 투여하고 6 Gy 방사선을 조사하여 변화를 관찰하였다. IR군과 IR+RSR군을 비교하여 보았을 때, 혼합 추출물 투여군에서 방사선에 의한 피해가 완화되었고 회복이 빠른 것을 확인하였다. 항산화 활성 효소를 측정해 본 결과, 혼합 추출물을 투여한 군에서 높은 활성 수치를 나타내었다. 이는 선행논문의 항산화 효소계 활성 상승효과와 유사한 기작이 나타난 것으로 사료된다. 따라서 본 연구는 수컷 흰 쥐(SD Rat)에서 홍삼, 삼백초, 복분자 혼합 추출물이 6 Gy 방사선에 방호 및 회복 효과를 나타낸 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 단독에 비해 미비한 천연 혼합 방사선 방호제 연구에 기초자료로 유용하게 활용될 것이라 기대한다.