Ⅰ. 서 론
황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus)은 사람에게 임상 감염을 일으키는 중요한 병원균으로[1], 특히 수술이나 상처 후 국소 감염을 일으키고 아토피 피부염을 갖은 환자의 피부에 대량으로 집락화 할 수 있다[2-4]. 또 한, 이 병원균은 농가진(impetigo) 및 봉와직염(cellulitis) 과 같은 피부 연조직 감염을 유발할 수 있으며, 이들 중 일 부는 생명을 위협할 수 있다[1,5].
S. aureus과 같은 병원성 박테리아에 감염된 환자의 가 장 일반적인 치료법은 항생제의 사용이다[6]. 그러나 항생 제에 대한 내성 균주의 수가 급격히 증가하면서 기존 약물 사용이 어려워지고 있다[7]. 특정 박테리아를 제거하는 방 법으로 국소 소독제가 있지만, 이 방법은 새로운 육아 조직 에 독소가 발생할 수 있어[8,9], S. aureus에 감염된 상처 부위의 치료로는 제한적이다.
항생제에 내성이 있는 박테리아에 의한 상처 감염을 치료 하는 다른 방법으로 광역학적 비활성화 요법 (photodynamic inactivation, PDI)이 있다. 이 방법은 특정 파장의 빛과 이 빛에 활성화되는 물질인 광과민제, 세포 내 산소를 이용하 는 방법이다. 이 원리는 광과민제와 결합한 기저 상태의 세 포가 특정 파장의 빛으로 활성화되면 단일항(singlet) 또는 삼중항 상태 (triplet state)인 더 높은 에너지 상태로 이동 한다. 이후 활성산소(reactive oxygen species)가 발생하여 세 포가 파괴되고 미생물의 DNA와 원형질막이 손상된다[10-13].
본 연구에서는 광역학 비활성화 요법을 위해 660 nm 다 이오드 레이저와 광과민제로 수용성 클로로필의 유도체인 라다클로린(radachlorin)을 사용하였다. 이는 주로 염화나 트륨 e6 (sodium chlorin e6)으로 어두운 곳에서는 독성이 낮지만, 특정 파장의 빛에서는 높은 광독성을 나타내고 체 내에서 빠르게 배설된다는 장점이 있다[14,15].
여러 연구에서 S. aureus에 대해 다양한 빛과 광과민제 를 이용한 PDI의 항균 효과가 입증되었다[5,6,9]. 그러나 660 nm 다이오드 레이저를 이용하여 S. aureus를 제거하 기 위한 적절한 레이저 투과 선량을 입증한 보고는 없었다. 따라서 본 연구에서는 S. aureus에 감염된 상처 부위를 치 료하기 위해 라다클로린 존재하에 660 nm 다이오드 레이저 의 적절한 투과 선량을 평가하는 것이다.
Ⅱ. 실험 재료 및 방법
1. 세균배양
본 연구에 이용된 표준 균주 S. aureus (ATCC 29213)는 대전에 있는 D대학교에서 제공 받았다. 이 균주는 50% Brain Heart Infusion(BHI) Broth에 접종하여 냉동고에 보관 후 혈액한천배지에 계대 배양하였다. 그 후 온도 37°의 5% CO2가 있는 곳에서 24시간 동안 성장시켜 사용 하였다.
2. 광과민제 및 광원
광과민제 라다클로린(RADA-PHARMA Co. Ltd., 모스 코바, 러시아) 0.1%은 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (Dulbecco’s phosphate-buffered saline)에서 1,000 μ g/mL로 희석하였다.
본 연구에 사용된 광원은 660 nm 다이오드 레이저 시스 템으로 세부 사양은 Table 1에 있다. S. aureus가 들어 있 는 페트리접시(Petri dish) 에 다이오드 레이저를 조사했고, 조사선량과 조사 시간에 대한 정보는 Table 2에 있다.
3. 실험 방법
현탁액에 멸균 탈이온 수(sterile deionized water)를 첨 가하여 박테리아를 약 1.5 × 105 cells/mL의 탁도로 조정 했다.
라다클로린 존재하에 레이저 조사의 광학적 비활성화를 증명하기 위해 세균 단독 군, 레이저 단독 조사 군, 라다클 로린 단독 군을 대조군으로 설정하였다(Table 2). 세균 단 독 군과 레이저 단독 조사 군에서는 55 mm 페트리 접시 (23.7 cm2)에 세균 현탁액 5 μL 와 멸균 식염수 5 μL를 접종하였다. 라다클로린 단독 군은 55 mm 페트리 접시 (23.7 cm2)에 세균 현탁액 5 μL와 라다클로린 5 μL를 접종하였다. 세균 단독 군과 라다클로린 단독 군에서는 37°인큐베이터(Vision Scientific Co., Ltd., 대전, 대한민 국)에서 24시간 보관 후 집락 수(CFU/mL)를 세었고, 레이 저 단독 조사 군에서는 시료를 37°인큐베이터에 30분간 보 관 후에 레이저를 9 J/cm2의 선량으로 조사하였다(Fig. 1).
광역학적 비활성화를 보고자 하는 PDI 군은 55 mm 페트 리 접시(23.7 cm2)에 세균 현탁액 5 μL와 라다클로린 5 μ L를 접종하여 37°인큐베이터에 30분간 보관 후에 빛을 조 사하였다(Fig. 1). 레이저 선량에 따는 효과를 보기 위해 3, 5, 7, 9 J/cm2로 레이저를 조사하였다. 레이저 조사 후 세포 를 37°5% CO2 배양기에서 24시간 동안 보관하고 집락 수 (CFU/mL)를 세었다. 모든 실험은 6회 반복되었다.
4. 통계 분석
데이터는 SPSS Statistics 소프트웨어(Version 25.0)를 사용하여 분석하였다. 레이저 선량에 따른 집락 수(CFU/mL) 는 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 통계적으로 분석하였 다. 또한, 사후 검정으로 Tukey HSD (honestly significant difference) test 방법을 사용하였고, P값이 0.05 미만인 결과는 유의미한 것으로 간주하였다(P<0.05).
Ⅲ. 결 과
1. 광역학 비활성화 후 집락 수(CFU/mL) 분석
본 연구 결과는 S. aureus의 모든 집락 수(CFU/mL)가 라다클로린이 있는 상태에서 다이오드 레이저 조사에 의해 감소되었음을 확인하였다(Fig. 2). 그러나 사멸 정도는 레 이저 선량에 따라 차이가 있었다. Fig. 3에 나타난 바와 같 이, S. aureus의 집락 수(CFU/mL)는 레이저 에너지 선량 이 증가함에 따라 감소하였다. 또한, 레이저 선량 9 J/cm2 에서 87.91%의 사멸률이 나타났다(Table 3). 일원 분산 분 석은 각 PDI에 대해 상당한 억제(F=375.261, P<0.05)를 보 여주었으며 사후 분석에서는 각 그룹에서 3, 5, 7, 9 J/cm2 의 레이저 에너지 선량에 따라 유의한 차이가 있었다.
2. 레이저 단독 조사와 라다클로린 단독 투여 시 집락 수(CFU/mL) 분석
Table 3에서 보듯이 라다클로린 없이 레이저만 조사한 그룹과 대조군 그룹을 비교한 결과 유의한 차이가 없어 레 이저 조사만으로는 살균 효과가 없음을 나타내었다. 또한, 레이저 조사 없이 라다클로린만 투여한 군도 대조군과 차이 가 없어 라다클로린의 독성을 관찰하지 못하였다(P >0.05).
Ⅳ. 고 찰
본 연구에서 라다클로린과 다이오드 레이저를 이용한 PDI가 S. aureu의 생존율을 줄이는데 상당히 효과적임을 보여주었다. 또한, 본 연구 결과는 9 J/cm2의 에너지 선량 에서 87.9%의 사멸률을 확인했다.
많은 연구에서 다양한 광원과 광과민제를 사용하여 S. aureus에 대한 PDI의 효과를 조사하였다[16-19]. Fekrazad 등은 라다클로린과 662 nm 다이오드 레이저 (12 J/cm2)를 이용하여 S. aureus의 집락 수가 6.28 log10으로 감소했음을 입증했다[19]. 또한, Thakuri 등은 리보플라빈 (riboflavin) 존재하에 청색 LED를 120분 동안 조사한 경 우 S. aureus의 성장이 크게 감소했음을 관찰하였다[17]. Topalogluet 등은 인도시아닌이(indocyanine) 있는 상태에 서 809 nm 다이오드 레이저를 84 J/cm2로 조사했을 때 야 생형 S. aureus의 95% 이상이 감소했다고 보고했다[6]. Hsieh 등은 5-아미노레블린산(5-aminolevulinic acid, ALA) 1.0 Mm과 630 ± 5 nm LED (90 min, 162 J/cm2) 조사가 S. aureus의 생존 수를 완전히 감소시켰다[16]. 그 러나 본 연구에서 라다클로린이 있는 상태에서 660 nm 다 이오드 레이저를 이용한 S. aureus의 PDI는 3 J/cm2에서 45.5%, 5 J/cm2에서 61.2%, 7 J/cm2에서 74.3%, 9 J/cm2 에서 87.9%의 사멸률을 보여주었다. 이는 이전 연구와 비교 하여 S. aureus에 대한 항균 효과는 9 J/cm2의 비교적 낮은 선량과 1,067 s의 낮은 레이저 조사 시간으로 87% 이상의 항균효과를 관찰하였다.
낮은 수준의 광선 요법은 미생물을 억제하는 것으로 나타 났다[20,21]. 여러 연구에서 여러 종류의 박테리아가 서로 다른 강도와 빛의 파장에 의해 사멸된다는 것이 입증되었다 [9,22]. 그러나 이 연구에서는 광과민제 없이 660 nm 다이 오드 레이저 단독 조사는 대조군과 비교하여 S. aureus의 집락 수를 감소시키지 않았다. 이는 660 nm 다이오드 레이 저 조사만으로는 S. aureus에 세포 독성 효과가 없다는 것 을 입증하였다. 이 결과는 Moslemi 등의 연구와 일치한다. 이들은 Aggregatibacter actinomycetemcomitans가 최대 출력 2.5 W의 662 nm 레이저의 6 J/cm2의 선량으로 조사 되었을 때 항균효과가 없음을 보여주었다[13]. 그러나 다른 연구에서는 감광제 없이 662 nm 레이저 조사 (6 J/cm2)가 Pseudomonas gingivalis의 집락 수를 감소시키는 것을 관 찰했다[23]. 또한, Vahabi 등은 660 nm 다이오드 레이저 3 J/cm2의 단독 조사로도 Streptococcus mutans 수가 예상 보다 많이 감소되는 것을 확인했다[14]. 이처럼 레이저 빛 의 항균 효과는 미생물의 종류와 상태에 따라 달라질 수 있 다[23]. 따라서 인간 세포와 여러 종류의 박테리아에서 다 이오드 레이저 조사가 독성 효과가 있는지에 대한 많은 연 구가 필요하다.
현재 광역학적 비활성화 요법은 암(cancers) 및 피부 사 상균(dermatophytes) 치료에 적용하여 연구되고 있다 [24-28]. Cornelius 등은 5-아미노레불린산을 이용한 광 역학 요법으로 인간 수막종 세포의 치료 효과를 확인하였고 [24], Morton 등은 저용량 클로트리마졸을 이용하여 피부 사상균인 Trichophyton rubrum의 사멸의 광역학 효과를 입증하였다[26]. 이 치료법은 비용이 적게 들고 재현 가능하 며 숙주 조직에 안전하다는 장점이 있어[13,19,29], 상처 감 염 치료를 위한 좋은 대안이 될 수 있다.
본 연구는 다이오드 레이저와 라다클로린을 이용한 광역 학 요법은 S. aureus의 성장을 억제하는데 매우 효과적이라 는 것을 입증하였다. 그러나 in vitro 분석에 국한되어 있어 추가적인 in vivo 실험이 필요하다.
Ⅴ. 결 론
위의 결론들을 종합하였을 때, 라다클로린과 660 nm 다 이오드 레이저를 이용한 광역학 요법은 S. aureus의 집락 수를 억제하는데 매우 효과적이었다. 또한, 레이저 선량이 증가할수록 S. aureus의 성장이 억제되었고, 9 J/cm2의 선 량으로도 87.9%의 사멸률을 관찰하였다. 이는 아토피 피부 염 및 상처 감염 환자에서 S. aureus에 감염된 부위의 집락 을 치료하기 위한 새로운 치료법으로 고려될 수 있음을 입 증하였다.
