Ⅰ. 서 론
칸디다증(candidiasis)은 피부, 구강 내 점막, 비뇨생식 기관 등의 질환을 일으키는 기회감염으로 주 원인균은 Candida albicans(C. albicans)이다[1,2]. 이 균은 인체의 정상적인 환경에서는 병원성이 없어 임상적 징후를 나타내 지 않지만 면역 체계가 심각하게 떨어졌을 때 증상을 일으 킨다[3,4]. 특히 표재성 피부 칸디다증(superficial cutaneous candidiasis)은 구강 칸디다증(oral candidiasis, thrush), 칸디다 구순염(candidal cheilosis, perleche), 칸디다 외음 부 질염(candidal vulvovagitis), 칸디다 귀두염(candida balnanitis), 항문주위 칸디다증(perianal candidiasis), 만성 피부점막 칸디다증(chronic mucocutaneous candidiasis) 등이 있으며 다양한 임상증상을 나타낸다[5]. 최근에 표재 성 피부 칸디다증이 증가하고 있는데 이는 후천성면역결핍 증 환자, 면역이 떨어진 환자, 당뇨환자, 항생제 남용 등에 의해 인체의 저항력이 저하되기 때문이다[5].
표재성 칸디다증에 대한 통상적인 치료법으로 국소 및 전 신 항진균제가 널리 사용되고 있다[6]. 그러나 이 약물은 인 체에 독성이 나타나고 칸디다 속 미생물에 의한 내성의 발 달로 항진균제를 이용한 치료는 더욱 어려워지고 있어[1], 새로운 치료법의 개발이 필요한 실정이다.
광역학 치료(Photodynamic therapy; PDT)는 체내의 풍 부한 산소, 외부에서 공급되는 빛, 빛에 민감한 반응을 보이 는 광감작제(Photosensitizer)를 병변 부위에 투여하고 광 감작제가 최적의 활성화되는 특정 파장의 빛을 조사하면 광 화학적, 광생물학적 기전을 통해 활성 산소가 생산되어 세포 사멸을 일으키는 암치료 방법이다[7,8]. 그러나 광역학 치 료는 빛의 투과 깊이에 한계가 있어 피부의 표재성 종양이 나 2 cm 미만의 고형암 등에 주로 이용되고 있다[9,10]. 광 역학 치료 효과를 높이기 위해서는 광원(light source)과 특 정 파장의 빛에 활성을 나타내는 광감작제가 필요하다[11]. 일반적으로 광감작제는 특정 파장의 빛에 노출되지 않으면 세포 독성을 일으키지 않지만, 활성을 일으키는 파장의 빛 에 노출되면 단일항 산소(superoxide, peroxide)를 생성 하면서 세포 독성을 나타낸다[12]. 현재 많이 이용되고 있고 국소 전달에 적합한 광감작제는 5-아미노레블린산 (5-aminolevulinic acid, ALA)과 메틸 아미노레블린산 (methyl aminolevulinic acid, ALA)이다[9]. 이는 제 2세 대 광감작제로 종양 내에서 Protoporphyrin IX (PpIX)로 변환되는 물질로서 635 nm 최대 흡수 파장을 가진다[13]. 반 면 본 연구에서는 광감작제로 Radachlorin을 사용하였는데 이는 sodium chlorin e6, sodium chlorin p6, purpurin 5 를 포함하는 3가지 chlorophyll 유도체의 혼합물로 662 ± 5 nm의 높은 최대 흡수 파장을 가지고 있다[14]. 한편 레이 저의 파장이 높아지면 조직에 투과되는 깊이가 깊어져 광 역학 치료 효과를 높일 수 있다. 기존의 주로 사용하던 aminolevulinic acid (ALA)가 635 nm영역에서 최대 활성 화를 보이는 반면, Radachlorin은 662 ± 5 nm로 높은 파 장의 빛에서 최대 활성화를 보이기 때문에 광역학 치료 시 조직에 투과력을 높일 수 있다는 장점이 있다[15]. 광역학 치료의 장점은 광섬유를 이용하여 레이저 조사 부위를 병변 부위에 제한시켜 정상 숙주 조직을 손상시키지 않으면서 박 테리아를 사멸할 수 있다[12,16]. 실제로 세균 및 진균의 항 균효과를 보기 위해 광감작제와 빛을 활용한 광역학 치료에 대한 연구들이 많이 있다[1,2,12,14,17]. 하지만 국내에는 아직까지 세균과 진균의 항균효과를 보기 위한 광역학 치료 에 대한 연구가 많이 이루어지지 않은 실정이다.
본 연구에서는 표재성 피부 칸디다증를 위한 치료법으로 광역학 치료를 제안한다. 이를 위하여 다이오드 레이저 기 기와 광감작제인 Radachlorin을 이용한 C. albicans 대한 항균효과를 제시하고자 한다.
Ⅱ. 실험 재료 및 방법
1. 세균주
본 연구에 사용된 표준 균주는 Candida albicans (ATCC 10231) 로 대전소재 D대학교에서 제공받았다. 이 균주는 nutrient broth에 성장시켜 5% CO2와 섭씨 37도의 온도가 유지되는 배양기(VISION SCIENTIFIC CO., LTD, VS-1203P1N)에서 24시간 동안 배양하여 사용하였다.
2. 광원과 광감작제
광원은 Radachlorin의 광독성 효과가 최대가 되는 660 nm 파장의 다이오드 레이저(PDToA-153, 닥터아이앤비, 대전, 한국)를 에너지 밀도 3 J/cm2 (356 s), 5 J/cm2 (593 s), 7 J/cm2 (823 s)로 사용하였다. 에너지 밀도(energy density) 는 노출시간 동안 단위면적에 레이저가 전달하는 총 에너지 로 정의한다.
레이저 출력 200mW, 조사 면적 23.7 cm2로 일정하게 유 지하고, 조사시간을 변경하여 에너지 밀도를 제공했다.
광감작제는 Radachlorin (RADA-PHARMA Co.Ltd., Moscow, Russia)을 0.1%로 제조하기 위해 Dulbecco’s phosphate buffered saline에 1,000 μg/mL로 희석하였다.
3. 집락수(Colony Forming Units) 측정
균주 부유액의 농도는 탁도계(Densicheck plus, biomeriex, USA)를 이용하여 McFarland No. 0.5로 맞춘 후 1.5 × 105cell/mL가 되도록 만들었다.
대조군과 레이저만 조사한 그룹에서는 생리식염수 100 μl 와 균주부유액 100 μl를 함께 Mueller-Hinton agar broth 에 혼합하여 Petri Dish 직경 55 mm (23.7 cm2)에 각 10 μl 씩 접종하고 알루미늄 호일을 이용하여 빛을 차단하여 섭씨 37° 온도가 유지되는 배양기에서 30분 동안 반응을 시켰다.
광역학 치료군과 Radachlorin만 투여한 그룹에서는 Radachlorin 100 μl와 균주부유액 100 μl를 함께 Mueller- Hinton agar broth에 혼합하여 Petri Dish 직경 55 mm (23,7 cm2)에 각 10 μl씩 접종하고 알루미늄 호일을 이용하 여 빛을 차단시켜 섭씨 37° 온도가 유지되는 배양기에서 30 분 동안 반응을 시켰다.
광역학 치료군과 레이저만 조사한 그룹은 레이저 에너지 밀도 3 J/cm2 (356 s), 5 J/cm2 (593 s), 7 J/cm2 (823 s)의 빛을 조사하였다[Fig. 1]. 그 후 48시간 동안 섭씨 37° 배양 기에서 산소성 배양 후 평판계수법으로 생성된 집락의 수를 세어 살균능력을 판정하였다.
대조군과 Radachlorin만 투여한 그룹은 섭씨 37° 온도가 유지되는 배양기에서 산소성 배양 후 48시간 후 평판계수법 으로 생성된 집락 수(CFU/ml)를 세었다. 실험 설계에 관한 자세한 정보는 <Table 1>에 있다. 이 실험은 각 그룹 당 총 6회 측정하였다.
4. 통계 분석
광감작제 투여 후 레이저 에너지밀도의 변화에 따른 생성 집락 수(CFU/ml)를 평판계수법으로 측정하고 유의미한 변 화를 분석하기 위하여 일원분산분석(One-way ANOVA)을 활용하였다. 또한, 실험 결과 유의미한 차이가 있을 경우 Tukey HSD 방법을 활용하여 사후 검정을 실시하였다. 유의 수준은 P<0.05로 하였으며, 통계분석에는 SPSS Statistics Version 25를 사용하였다.
Ⅲ. 결 과
본 실험 결과를 요약하면 다음과 같다. Radachlorin과 다이오드 레이저를 이용한 광역학요법은 C. albicans의 생 성 집락 수를 감소시켜, 이는 C. albicans에 항균 효과가 있 음을 입증하였다.
1. 광역학 치료(Photodynamic therapy) 효과
광역학 치료(Photodynamic therapy groups) PS+L+(3), PS+L+(5), PS+L+(7)에서는 각각의 평균 1.06 x 105, 7.2 × 104, 3.26 x 104 개의 생성 집락 수가 형성되었다<Table 2>. Radachlorin존재하에 다이오드 레이저 조사는 레이저 에너 지 밀도가 증가함에 따라 C. albicans의 생성 집락 수가 감 소함을 보여주었고 통계적으로 유의미한 차이를 보였다 (P<0.05)[Fig. 2]. 또한, [Fig. 4]에서 보듯이 Radachlorin 존재하에 다이오드 레이저 조사는 7 J/㎠의 선량으로도 91.5%의 kill rate를 관찰하였다. 각 실험 모든 구간에서 통 계적으로 유의미한 차이를 보이는 것을 통계 사후(Tukey HDS) 검증 방법을 활용하여 확인하였다.
2. Radachlorin 단독 투여와 다이오드 레이저 단독 조사효과
대조그룹(Control groups) PS-L-, PS+L-, PS-L+(7) 의 생성 집락 수는 평균 3.95 x 105, 3.84 x 105, 3.83 x 105 개가 형성되었다[Fig. 3]. 본 실험에서 광감작제 없이 레이 저만 조사한 그룹과 대조군 그룹을 비교한 결과 유의미하지 않다는 결과가 나왔다(P >0.05). 또한, 레이저 조사 없이 광 감작제 Radachlorin만 투여한 군과 대조군 그룹을 비교한 결과, 유의미하지 않다는 결과가 나왔다(P >0.05). 이는 Radachlorin 단독 투여와 다이오드 레이저 단독 조사는 C. albicans대한 항균 효과가 없음을 보여준다.
Ⅳ. 고 찰
본 연구에서는 다이오드 레이저와 Radachlorin을 이용한 광역학 치료는 C. albicans의 성장을 감소시키는 것을 증명 하였다.
광역학 치료에 의해 세균에 치명적인 손상을 주는 과정은 두 가지가 있다. 첫 번째는 DNA의 손상이고 두 번째는 세포 막 단백질의 변형이다, 그것은 빛과 광감작제가 DNA 손상 을 일으켜 세균의 비활성화에 영향을 끼치는 것으로 알려져 왔다[18].
여러 연구에서 다양한 광원과 광감작제를 이용하여 C. albicans에 대한 광역학 치료 효과를 조사하였다[1,17,19,26]. Mima 등은 광감작제 Potogem과 455 nm, 630 nm LED (305 J/cm2)를 이용한 광역학 치료에서 쥐의 혀에 있는 C. albicans의 집락 수가 유의하게 감소하는 것을 관찰했다 [19]. Souza는 광감작제 메틸렌 블루, 톨루이딘 블루, 말라 카이트 그린과 660 nm GaAlAs 레이저(15.8 J/cm2, 26.3 J/cm2, 39.5 J/cm2)를 조사한 광역학 치료에서 C. albicans 의 항균효과를 증명했다[1]. Giroldo는 메틸렌 블루와 684 nm 다이오드 레이저(28 J/cm2)를 이용한 광역학요법에서 C. albicans의 성장이 현저히 감소했다고 보고했다[17].
본 연구에서는 Radachlorin과 660 nm 다이오드 레이저 를 3 J/cm2의 에너지 밀도로 조사한 한 군에서 72.34%, 5 J/cm2 에너지 밀도로 조사한 군에서 81.21%, 7 J/cm2의 에너지 밀도로 조사한 군에서 91.5%의 kill rate을 보였다. 이는 앞서 기술한 선행연구들에 비해 비교적 적은 에너지 밀도 7 J/cm2로 Candida albicans의 항균효과를 보였다 [1,17,19]. 한편, 광역학 치료 시 광원을 과다 조사하여 열 효과(thermal effect)가 일어나면 수포생성, 궤양형성, 피 부괴사 같은 부작용이 생길 수 있다고 하였다[20]. 그러나 선행 연구와 우리의 연구를 비교하는 것은 불가능 하지만 이는 LED와 다르게 레이저는 일관된 빛을 방출하는 단색성 단방향성의 성질을 갖고 있어 빛의 많은 부분이 광감작제와 결합하여 흡수할 수 있는 능력이 있다[14]. 또한, 광감작제 인 Radachlorin의 광 물리적 특성과 관련이 있을 수 있다 [12,21-23].
본 연구에서는 Radachlorin만 투여했을 때에는 C. albicans 의 수를 감소시키지 않았다. 이는 광감작제 Radachlorin 단독으로는 C. albicans에 대한 세포 독성 효과가 없음을 시사한다. 또한, 광감작제 없이 660 nm 다이오드 레이저만 조사했을 때에도 C. albicans의 성장에 어떠한 영향도 미치 지 못했다. 이러한 결과는 660 nm 다이오드 레이저 조사는 C. albicans대한 세포 독성 효과를 발휘하지 못함을 시사한 다. 이 발견은 Queiroga의 연구와 일치한다. 그들은 660 nm GaAlAs 레이저(40 mW)를 60 J/cm2, 120 J/cm2, 180 J/cm2 의 에너지 밀도로 조사했을 때 Candida spp.의 살균 효과가 없음을 평가했다[24]. 그러나 Souza 등은 660 nm GaAlAs 레이저(35 mW) 15.8 J/cm2, 26.3 J/cm2, 39.5 J/cm2로 조 사했을 때 C. albicans log CFU/ml의 수가 감소되는 것을 관찰하였다[1]. 우리의 연구와 문헌에서 보고된 결과 사이의 차이는 레이저의 물리적 특성과 광역학 치료에 사용에 대한 사전 정의된 매개 변수의 부족으로 인한 것일 수 있다. 또 한, 미생물의 생리학적 상태와 농도 레이저의 출력, 노출시 간, 에너지 밀도 등이 광역학 치료 효과에 영향을 줄 수 있 다[1,25]. 그러므로 레이저와 인간세포 박테리아에 대한 많 은 연구가 필요하다. 또한, 광감작제, 레이저, 미생물의 종 류에 따라 in vitro와 in vivo의 연구 결과가 다를 수 있어, 우리는 in vitro 실험에서 확인하지 못한 in vivo에서의 항 균 효과(Antimicrobial effect)를 관찰하기 위하여 미래에 추가적으로 이와 관련된 연구를 진행할 예정이다.
Ⅴ. 결 론
본 연구에서는 다이오드 레이저와 Radachlorin을 이용한 광역학 치료는 C. albicans의 성장을 억제하는데 매우 효 과적이라는 것을 입증하였으므로 표재성 칸디다증에 감염 된 환자를 위한 새로운 치료법으로 고려될 수 있음을 제시 한다.
