Ⅰ. 서 론
인체가 방사선에 피폭되면 조직에 직접적으로 손상을 주 는 직접작용과 자유라디칼 및 활성산소를 생성하여 간접적 으로 손상을 주는 간접작용이 발생한다. 그 중 간접작용에 의한 손상은 인체에 약 75 % 이상 작용하는데 방사선과 물 분자의 상호작용으로 생성된 자유라디칼 및 활성산소가 인 체 내 DNA를 손상시킨다[1].
항산화 물질은 이러한 자유라디칼 및 활성산소를 제거하 는 작용을 가진 물질로써 자유라디칼 및 활성산소로 부터 발생한 손상을 재생 및 복구하여 피해를 최소화하는 중요한 역할을 한다[2-3]. 항산화 물질은 화학적 합성물을 이용한 연구를 시작으로 방사선 방호제 연구가 진행되었지만 화학 적 합성물은 독성이 강하고 부작용이 많아 최근에는 천연물 질을 이용한 방사선 방호제의 중요성이 높아지고 있어 연구 및 개발이 활발히 이루어지고 있다[4-8].
흰점박이꽃무지(protaetia brevitarsis)는 항산화 물질을 함유한 딱정벌레목 꽃무지과에 속하는 곤충으로 이것의 유 충(larvae)을 굼벵이라고 부른다[9]. 전체 길이는 약 17 ∼ 24 mm 정도의 식식성 곤충으로 올레산 (oleic acid), 팔미 트산 (palmitic acid), 팔미톨레산 (palmitoleic acid), 리놀 레산 (linoleic acid), 스테아르산 (stearic acid) 등을 함유 하고 있어 항암 및 항산화 효과가 있다고 보고되고 있다 [10-13]. 또한 여러 약리적인 효과를 갖추고 있어 식품공전 에 정식 등재되면서 전 세계적으로 미래 식량자원으로써의 관심 및 연구가 증대되고 있지만 아직까지 방사선 피폭에 따른 방호효과에 관한 연구는 전무한 실정이다.
본 연구에서는 흰점박이꽃무지 유충 추출물이 방사선 방 호제로써의 가능성을 알아보기 위하여 수컷 SD Rat에 흰점 박이꽃무지 유충 추출물을 투여하고 방사선 피폭에 따른 방 호효과를 규명하고자 하였다.
Ⅱ. 대상 및 방법
1. 흰점박이꽃무지 유충 추출물 제조
흰점박이꽃무지 유충은 무선산 굼벵이 농장(Jinju; Korea) 에서 공급받아 사용하였다. 흰점박이꽃무지 3령 유충을 절 식상태로 배변을 유도한 후 1주일 동안 냉동 건조하여 보관 하였다. 이후 분쇄하여 얻은 분말시료 50 g과 70%에탄올 2 L를 혼합하여 3시간 동안 90 ℃에서 끓여 에탄올을 제거하 였고 3회 반복하여 추출한 후 여과지(Whatman International Ltd, Maidstone, UK)로 여과하여 획득한 시료를 실험에 사 용하였다.
2. 실험동물 관리 및 사육
실험동물과 관련된 모든 취급은 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC) 의 승인 (승인번호: 인제 2020-019호)하에 수행되었다. 실 험동물은 4주령의 실험용 수컷 쥐 (Sprague-Dawly Rat, Hana Biotech, Pyeongtaek, Korea)를 사용하였다. 환경 은 온도 21±2 °C, 습도 55±5 %, 조명 12 hour/day 로 조성 하였다. 1주일간의 검역 순화기간을 가졌으며 실험은 Table 1과 같이 일반군 (NC), 흰점박이꽃무지 유충 추출물투여군 (PBE), 방사선조사군 (IR), 흰점박이꽃무지 유충 추출물 투 여 후 방사선조사군 (PBE+IR), 방사선 조사 후 흰점박이꽃 무지 유충 추출물투여군 (IR+PBE)으로 5개의 그룹으로 나누 어 편성하였다. 흰점박이꽃무지 유충 추출물은 200 mg/kg 용량으로 매일 1회 2 cc를 경구투여용 존대(oral zonde)를 이용하여 14일간 투여하였다. 방사선 조사에 따라 1일차, 7 일차, 21일차에 혈구 성분변화, 항산화 효소(SOD) 활성, 조 직 병리학적인 분석을 하였다.
3. 방사선 조사
실험동물의 방사선 조사는 Fig. 1과 같이 저준위 감마선 조사장치인 IR-222 Dry Storage Irradiator (MDS Nordion, Canada)를 이용하였다. 방사선이 정확하게 조사되기 위하 여 동물전용 종이 케이스(60.5 × 32.5 × 23 cm3)를 실험동 물을 넣고 Co-60 선원으로부터 192.5 cm거리에서 1.17 MeV, 1.33 MeV의 감마선을 7 Gy/h의 선량률로 1시간 동안 전신을 향해 조사하였다.
4. 혈액학적 관찰
채취혈액은 방사선 조사 후 1일, 7일, 21일에 SD Rat의 복강 대정맥을 통해 얻었다. 채취 후 동물용 EDTA 0.5 cc Tube에 보관 후 즉시 Coulter mixer를 이용하여 응고를 방지 하였다. 혈액은 동물전용 혈구분석기(mindray BC-2800VET, China)를 이용하여 백혈구와 혈소판을 분석하였다. 통계적 유의성을 위해 각 군은 개체 당 3회의 혈액검사를 시행하여 총 횟수의 평균값을 이용하였다.
5. SOD assay
Marklund 등[14] 기법을 응용하여 SOD(superoxide dismutase)의 활성도를 측정하였다. 방사선 조사 후 7일, 21일차에 실험동물 SD Rat의 정맥을 통해 채취한 혈액은 4 °C에서 600 g로 10분간 원심분리 하여 혈장을 시료로 준 비하였다. SOD 활성을 측정하기 위해 시료를 Dilution buffer로 1, 1/5, 1/52, 1/53, 1/54, 1/55, 1/56의 비율별로 희 석하였고 SOD Assay kit –WST (Dojindo Inc, R°Ckville, MD, Japan)를 사용하여 제공된 매뉴얼 방법에 따라 시료 20 μL를 96-well plate에 분주하였다. SOD activity는 ELISA reader (biotek, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡 광도를 측정하여 계산하였다.
6. 조직학적 분석
관찰 대상인 간, 전립선은 방사선 조사 후 1일, 7일, 21일 차에 채취하였다. 적출한 조직은 10 % Formalin을 제조 하여 보관한 후 70 % Ethanol로 조직을 탈수한 후 Xylene으로 치환하여 Paraffin bl°Ck을 제작하였다. 제작 한 Paraffin bl°Ck을 슬라이드로 분할하여 Hemotoxylin and Eosin Stain (H&E staining)하여 광학 현미경으로 관 찰하였다.
7. 통계 처리 및 분석
실험결과는 IBM SPSS statistics version 26을 이용하 여 T-test로 분석하여 평균 ± 표준편차(Mean±SD)로 표시 하였다. p<0.05 수준에서 각 실험 군 간의 유의성을 검정하 였다.
Ⅲ. 결 과
1. 혈액학적 관찰
방사선 조사 후 1일차에는 Table 2와 같이 백혈구의 수치 가 IR Group에 비하여 PBE+IR Group (p<0.05)에서 유의 하게 감소가 완화되었고, 7일차에는 Table 3과 같이 혈소판 의 수치가 IR Group에 비하여 PBE+IR Group (p<0.01)과 IR+PBE Group (p<0.05)에서 유의하게 감소가 완화되어 방사선 방어효과가 나타났다.
방사선 조사 후 21일차에는 Table 2, 3과 같이 백혈구, 혈소판의 수치가 IR Group에 비하여 PBE+IR Group (p<0.01)과 IR+PBE Group (p<0.01)에서 유의하게 증가하 여 회복하였다
2. SOD assay
방사선 조사 후 7일차에 혈액 SOD 활성도는 Table 4와 같이 방사선 조사군인 IR Group (3.25±0.54 U/ml), PBE+IR Group (23.05±1.17 U/ml), IR+PBE Group (38.55±0.85 U/ml)에서 뚜렷하게 감소한 활성이 나타났 다. 방사선 조사 후 21일차에 혈액 SOD 활성도는 IR Group 에 비하여 PBE+IR Group (p<0.01)과 IR+PBE Group (p<0.01)에서 유의하게 증가하여 더 높은 활성을 나타내 었다.
3. 조직학적 관찰
방사선 조사 후 간 Fig. 2와 전립샘 Fig. 3은 NC Group과 PBE Group에서는 세포질이 균질한 형태를 나타내고 있었지만 방사선이 조사된 IR Group, PBE+IR Group, IR+PBE Group 에서는 세포질의 팽창과 일부 핵이 응축된 형태의 소견이 관찰 되었다. 간은 IR Group에 비하여 PBE+IR Group에서, 전립샘 은 IR Group에 비하여 PBE+IR Group과 IR+PBE Group에서 는 세포질의 팽창 및 핵의 응축된 형태가 소폭 감소되었다.
Ⅳ. 고 찰
본 연구에서는 흰점박이꽃무지 유충 추출물의 방사선 방 호효과를 확인하기 위하여 흰점박이꽃무지 유충 추출물을 경구투여하고 방사선을 조사하여 1일차, 7일차, 21일차에 혈구 성분변화, 항산화 효소(SOD) 활성, 조직 병리학적인 분석을 하였다.
혈구 성분은 IR Group과 비교하여 1일차에는 PBE+IR Group의 백혈구(p<0.05), 7일차에는 PBE+IR Group의 혈 소판(p<0.01)과 IR+PBE Group의 혈소판(p<0.05)에서 유 의하게 감소가 완화되었고. 21일차에는 IR Group과 비교하 여 PBE+IR Group의 백혈구(p<0.01), 혈소판(p<0.01)과 IR+PBE Group의 백혈구(p<0.01), 혈소판(p<0.01)에서 유 의하게 증가한 회복이 나타났다. 따라서 흰점박이꽃무지 유 충 추출물은 방사선 피폭에 의한 혈액 성분변화에 대해 방 호효과가 있는 것으로 사료된다. 특히 선행연구[6-10]와 비 교하여 본 연구에서는 방사선을 조사한 후 물질을 투여한 IR+PBE Group을 추가하였다. 방사선 조사 후 흰점박이꽃 무지 유충 추출물을 투여한 IR+PBE Group은 7일차부터 혈 소판의 감소에 대한 방어를 나타내기 시작하여 21일차에는 백혈구, 혈소판에 대한 회복효과가 뚜렷하게 나타났다. 이 는 방사선에 의해 손상된 혈액 성분이 흰점박이꽃무지 유충 추출물에 의해 회복된 것으로 사료된다.
항산화 효소(SOD) 활성도는 7일차에는 방사선을 조사한 IR Group, PBE+IR Group, IR+PBE Group에서 뚜렷하게 감소하는 활성이 나타났고, 21일차에는 IR Group에 비하여 PBE+IR Group (p<0.01)과 IR+PBE Group (p<0.01)에서 유의하게 증가한 활성이 나타났다. 이로써 흰점박이꽃무지 유충 추출물이 SOD의 활성을 증가시킴으로써 방사선 방호 효과를 확인하였다. SOD 활성의 증가가 방사선에 대한 저 항성을 증가시킨다는 보고[15]에 따라 흰점박이꽃무지 유충 추출물은 SOD 활성을 증가시키는 성분으로 방사선 방호효 과를 나타내는 것으로 사료된다.
흰점박이꽃무지 유충은 에탄올 및 사염화탄소에 의한 간 손상을 보호하는 것으로 보고되고 있다[16-17]. 간은 IR Group에 비해 PBE+IR Group에서는 세포질의 팽창과 핵 의 응축이 소폭 감소된 것이 관찰되어 흰점박이꽃무지 유충 추출물이 방사선조사로 인한 간 손상을 줄이는 효과를 확인 하였다. 전립샘은 IR Group에 비해 PBE+IR Group과 IR+PBE Group에서는 세포질의 팽창돠 핵이 응축이 소폭 감소되었다. 흰점박이꽃무지 유충 추출물이 방사선 조사로 인한 전립샘에 방사선 방어효과를 나타내며 손상된 세포의 복구를 촉진시켜 전립선에 중요한 방호역할을 하는 것으로 사료된다.
Ⅴ. 결 론
인체가 방사선에 노출될 때 흰점박이꽃무지 유충 추출물 의 방사선 방호효과를 확인하기 위해 7 Gy의 Co-60 감마선 을 SD Rat에 조사하여 실험하였다. 흰점박이꽃무지 유충 추출물 섭취 후 방사선 조사를 받은 군과 방사선 조사 후 흰 점박이꽃무지 유충 추출물을 섭취한 군은 방사선 조사만 받 은 군에 비하여 백혈구와 혈소판에서 감소가 완화되고 회복 이 촉진되는 것을 확인하였다. 또한 SOD 활성에서 activity 의 증가로 항산화 활성을 확인하였고, 간과 전립선에서는 세포의 손상이 완화되는 것을 확인하였다.
따라서 본 연구는 흰점박이꽃무지 유충 추출물이 방사선 피폭에 따른 방호기전에 기여하는 것을 확인한 것으로 제시 된 결과물은 흰점박이꽃무지 유충을 이용한 방사선방호제 연구에 유용한 기초적인 자료로 사용될 수 있을 것으로 기 대된다.
