Ⅰ. 서 론

생체에서 방사선 에너지에 의한 손상은 세포 분열이 많을 수록 증가한다[1]. 그 중 대표적인 분열은 정자형성과정과 난자형성과정이다. 특히 난소는 생식세포인 난자를 생성하 는 과정에서 미분화된 세포들이 난조세포 주변에 많이 형성 되어 방사선의 감수성이 높다[18]. 이러한 난자 형성과정은 많은 여포세포가 난자를 에워싸고 난포호르몬, 항체호르몬 을 합성하여 성숙난자를 만든다[9]. 탄생의 시점에서 난소 는 난조세포가 증식, 분화하여 제1차, 2차 감수분열을 통하 여 난모세포로 성장한다. 성장 후 배란 시에는 가장 큰 여포 가 터져 난소로부터 2차 난모세포를 방출시키는 단계를 가 진다[6]. 따라서 분열 과정에서 방사선 등에 상해를 받으면 난모세포의 성장에 장해를 받는다. 지금까지 알려진 제 1 난 모세포의 수를 반감시키는 X-선 선량은 생쥐(mouse)가 0.1 Gy, 쥐(rat) 1 Gy, 원숭이는 9 Gy 이상인 것으로 연구되었 으며, 개체의 크기가 작을수록 방사선 감수성이 민감하게 나타났다[5]. 또한 생쥐에 전신 3 Gy를 피폭시키면 난자와 여포세포는 3일 후 핵이 농축되고 공포가 형성되는 장해를 가져오는 것으로 보고되었다[5]. 난소조직에서 방사선 장해 는 난자형성 초기가 가장 높게 나타났으며, 항체, 간질세포, 여포세포, 난자 순으로 성장 단계가 높을수록 낮아지는 것 으로 알려졌다[1,5]. 이러한 손상에는 각 단계별로 미분화된 소기관들의 장해가 선행되기 때문이라고 할 수 있다.

최근 연구에 의하면 난소에 X선 6 Gy를 조사한 실험에서 성장 난포의 과립층 및 핵과 세포질이 위축된 것으로 보고 되었으며 방사선에 의한 apoptosis 유도 유전자도 일부 확 인되었다[7-8]. 하지만 난자형성 과정에서 주변 세포를 구 성하고 있는 미토콘드리아, 소포체, 골지체를 포함한 핵막 과 핵소체에 대한 미세구조의 손상을 밝히는 연구는 부족한 실정이다. 또한 손상을 최소화 할 수 있는 방호제 연구도 필 요하다. 지금까지 알려진 방호제 물질로는 SH 화합물이 선 량감소 효과가 있는 것으로 보고되었다[1,5]. 화합물 방호제 에 대한 문제점은 투여 시 부작용이 있고 방호기전에 대한 평가가 부족하다는 것이다[16]. 따라서 안전한 천연물질의 연구가 필요한 실정이다.

천연방사선 방어물질로는 인삼성분의 사포닌이나 꿀벌에 서 추출한 프로폴리스 등이 연구되었으며 방호효과도 일부 확인되고 있다[10-12, 17]. 또한 최근에는 매운 맛과 강한 냄새를 가지고 요리에 활용되는 마늘 성분으로 알려진 알리 인(alliin)에 대한 연구도 활발하게 진행되고 있다. 알리인 은 알리신으로 분해되어 강한 냄새가 나고 항균작용 및 세 균의 발육을 억제하고 항암효과가 있는 것으로 알려져 있다 [13-15]. 지금 까지 알려진 알리인의 연구를 보면, 혈소판 에 대한 방호효과에서 1. 2차 과립들과 세포막에서 지질과 산화에 따른 이중막의 손상을 방어하는 것으로 알려졌다 [2-3]. X선 조사에 의한 간 조직의 미세구조 연구에서도 핵 막과 주변 조면소포체 및 미토콘드리아의 형태적 손상에 방 호효과가 있는 것으로 확인되었다[4].

따라서 본 연구는 난소의 난자형성과정에서 발생되는 각 단계별 미분화 세포에서 방사선 에너지에 의한 형태학적 손 상을 알아보고자 하였다. 그 일환으로 흰쥐에 전신 7Gy X선 을 피폭하여 일정 간격으로 희생하여 난포의 형성과정에서 주변 세포들과 소기관들에 대한 손상 기전을 밝히고, 알리 인을 투여하여 천연물질의 방호효과를 알아보고자 하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 실험동물 준비 및 X- 조사

실험을 위한 흰쥐는 200～250 g 크기의 암컷 24 마리를 사용하였다. 실험은 대조군, 방사선 조사군, 알리인 투여 후 방사선 조사군 으로 구분하였다. 방사선 조사 후 15일, 20 일, 30일, 40일 간격으로 실험 군 별로 2 마리씩 희생시킨 후 난소 조직을 적출하여 시료로 사용하였다(Table 1).

방사선조사는 선형가속기(Linac 21 EX-S, USA, 2006) 을 이용하여 6 Mev X선으로 대향이문조사를 실시하였다. 실험동물은 가로 30 ㎝ × 세로 30 ㎝로 특수 제작한 상자에 넣고 윗부분은 투명 아크릴로 덮은 후 높이를 같게 하였다. 방사선 조사는 SSD는 98 ㎝로 고정하고 심부 선량을 2 ㎝로 한 다음 전신 7 Gy로 X선을 조사하였다(Fig. 1).

2. 알리인(alliin)의 준비 및 투여

마늘성분인 알리인(CH2＝CHCH2SOCH2 CHNH2COOH) 은 알리신의 전구체로서 알리나아제의 효소 작용에 의해 매 운 맛과 냄새가 나는 알리신으로 변한다. 본 실험을 위해 사 용된 시약은 SIGMA-ALDRICH Korea에서 구입한 알리인 (Synonym: 3-(2-Propenylsulfinyl) -L-alanine, S-Allyl- L-cysteine sulfoxide, L-Alliin)은 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 백색의 동결 건조된 고체 분말 10 mg 2개를 사용하였다. 알리인의 투여는 흰쥐를 고정틀 에 고정시킨 후 꼬리정맥을 통하여 투여하였다. 투여량은 생리식염수 5 ml에 알리인 분말 10 mg 1개를 희석하여 사 용하였다. 투여량은 방사선 조사 직전 한 마리당 희석된 1 ml을 정맥 투여하였다(Fig. 2).

3. 난소 조직의 전자현미경 시료제작

난소 조직을 적출하여 시료제작을 위해 약품처리는 glutaraldehyde (2.5%, Polyscience)에서 3시간 동안 전고정 한 후, osmmium tetraoxide (1%, Polyscience)로 1시간 30분 후 고정하였다. 이후 ethyl alcohol (Merck)을 사용하여 계대 탈수과정을 시행하고, propylene oxide (Merck)로 치환하였 다. epon resin (polyscience)에 포매하여 60℃ 배양기에서 48시간 중합하여 block을 제작하였다. ultra microtome (Leica, Ultra-S, 2003)을 이용하여 80 nm로 박절 후 uranyl acetate (Polyscience)와 lead nitrate (Polyscience)로 이중 염색하여 투과전자현미경(H-7000, Hitachi, Japan)으로 관 찰하였다(Fig. 3).

Ⅲ. 결 과

1. 정상 난소의 난자형성세포 전자현미경 관찰

난소에서 여포의 발생단계는 난소 가장자리에서 1차 여포 (follicle)가 위치하고 단일층으로 되어있다(Fig. 4 A, B). FSH에 의해 난모세포와 여포는 성장 분열하여 1차 난모세 포를 둘러싸는 과립막 세포(granulosa cell) 층을 만든다. 이후 1차 여포는 계속 성장하여 소포(vesicle)를 만들고 2차 여포가 된다. 소포와 융합하여 여포강(antrum)을 형성하는 시기를 성숙여포(mature follicle) 또는 그라프여포라고 한 다. 여포가 발생하면서 1차 난모세포(occyte)는 첫 감수분 열을 하고 2차 난모세포는 세포질을 갖는다. 2차 난모세포 는 제2 감수분열을 하게 된다(Fig. 4 B). 여포의 과립막 세 포는 난모세포 주위에 고리를 형성하고 난모세포를 지지하 는 융기(mound)를 형성한다. 난모세포의 구조적 특징은 성 숙단계에서 세포 소기관들이 증가되고, 발달한 골지장치와 더불어 핵 주변에서 미토콘드리아와 조면소포체가 많이 분 포된다(Fig. 4 C, D). 이때 풍부한 유리 리보좀에 의해 세포 질은 진한 검은색을 띤다. 2차 난모세포의 형태상 특징은 바깥에 투명대가 있으며 그 외측으로 과립층이 형성되고 기 저막을 경계로 내난포막이 뚜렷한 방사상 모양을 하고 있어 방사관(corona rsdiata)이라고 한다. 내난포막을 구성하는 세포질에는 지방과립이 많이 분포되어 있어 성선자극호르 몬(FSH)을 투여하면 현저하게 증가한다.

2. 7Gy X선 조사 후 난소 조직의 관찰

1) X선 조사 후 15일 된 난소 조직의 관찰

난조세포의 막이 손상되어 일부분에서는 불규칙하게 변 형되어 있었으며, 난조세포 사이 간질에 형성된 섬유모세포 도 가장자리 형태가 손상된 모양으로 관찰되었다. 하지만 핵 주변에 골지장치와 미토콘드리아는 풍부하게 관찰되었 다(Fig. 5 A). 또한 전체적인 장해는 확인되지 않았으나 일 부 세포에서 공포화 된 부분이 여러 곳에서 확인되었다. 그 림 B에서는 이중막으로 된 핵막의 경계가 불분명하계 관찰 되었고, 거친 형태의 경화된 것으로 확인되었으며(Bk NM), 핵막 가장자리도 공포화(v) 되어 염색질이 일부 소실된 형 태로 확인되었다(Fig. 5 B). 미토콘드리아의 형태는 내부 크리스타 형태가 일정하게 구핵을 유지하고 있어 손상이 적 은 것으로 관찰되었다. 또한 핵막의 소실로 핵소체가 세포 질내로 유입되는 모습이 관찰되고 리보좀이 소포체에서 떨 어져 흩어진 형태로 관찰되었다(Fig. 5 C). 내난포막(TI)을 구성하는 세포질에는 지방과립이 많이 분포되었으나 서로 엉킨 상태로 복잡하게 구성되어 있었으며 섬유모세포에서 일부분이 손상(Da)되어 막의 형태가 분명하지 않은 것으로 관찰되었다. 주변의 미토콘드리아는 일부에서 분명하게 관 찰된 것으로 확인되었다(Fig. 5 D).

2) X선 조사 후 20일, 30일 된 난소 조직의 관찰

7 Gy 방사선 조사 후 20일된 난조세포에서는 지방소적의 증가를 볼 수 있으며, 핵소체는 선명하고 진하게 확인되었 다, 세포질에서 과립들의 손상은 없었다. 일부 큰 소기관에 서는 한쪽막이 옅은 농도로 두꺼워져 있었으며, 막 속의 내 용물이 밖으로 유출된 것으로 확인되었다. 또한 자가소화과 정이나 낡은 세포 소기관과 노폐물 및 식작용의 산물들을 소화하는 2차 리소좀이 확인되었다(Fig. 6 A, B). 이러한 현상은 세포사멸(apoptosis) 과정에서 나타나며, 배아 발생 과정에서 확인된다. 30일 후의 난조세포의 관찰에서는 핵막 이 일부 함몰된 것을 볼 수 있었으나 염색질은 일정하게 분 포된 것으로 확인되었다. 20일까지 손상이 없었던 미토콘드 리아에서 내외막이 분리되었으며, 일부에서는 공포화된 부 분이 관찰되었고 30% 정도에서는 일부 막은 엷은 두께로 층 이 비후된 것으로 확인되었다(Fig. 6 C, D).

3) X선 조사 후 40일 된 난소 조직의 관찰

지방소직들이 과산화 되어 형태가 일그러져 있었으며, 세 포질에는 소기관들이 서로 엉킨 상태로 가장자리의 윤곽이 구별되지 않았다(Fig. 7 A). 일부의 미토콘드리아의 윤곽이 선명하지 않았으며, 일부에서는 지방소적과 붙어 공포화 되 어 손상되었다. 핵 주변에서 관찰되는 리보좀들이 소포체에 서 이탈되었고 소기관들이 서로 달라붙어 가장자리 형태가 구분되지 않았다. 일부에서는 공포화 되어 손상된 모습으로 확인되었다(Fig. 7 B).

3. 알리인 투여 후 7Gy 조사한 난소 조직의 관찰

1) 알리인 투여 후 15일, 20일 된 난소 조직의 관찰

알리인 투여 후 15일 지난 난조세포에서는 세포막이 일부 함몰되어 있었지만 전체적인 윤곽에서 볼 때 손상의 정도는 심하게 관찰되지 않았다. 핵의 모양은 정상적으로 관찰되었 고, 주변 섬유모세포도 크기나 형태적인 손상은 정상적인 모양으로 관찰되었다. 혈관 벽에서도 두께가 일정하게 유지 된 것으로 관찰되었다(Fig. 8 A). 미토콘드리아 속의 크리 스테도 정상적으로 확인되고 핵막의 이중구조도 정상적으 로 관찰되었다(Fig. 8 B). 20일된 난소조직에서는 난모상피 세포들이 정상적인 형태를 유지하고 가장자리의 막의 윤곽 도 선명하게 관찰되었다(Fig. 8 C). 난모세포의 핵 주변에 는 많은 수의 미토콘드리아의 형태가 정상적으로 확인되었 으며, 내외‧분비선에서 생산되어 농축된 분비과립이 진하게 염색되었고, 지방소적도 선명하게 관찰되었다(Fig. 8 D).

2) 알리인 투여 후 30일, 40일 된 난소 조직의 관찰

난소의 2차 난포의 내난포막을 구성하는 세포질에는 지 방과립이 많이 분포되어 있었으며 이러한 지질소적들은 방 사선에 손상되지 않는 것으로 관찰되었다. 또한 기저막 외 부의 내 난포막 세포 주변에 분비과립이 현저하게 증가하여 성선자극호르몬(FSH)의 분비가 촉진되는 것으로 보여 진 다. 각 소기관들의 형태는 선명하게 정상적으로 관찰되었다 (Fig. 9 A , B). 40일된 난소조직에서는 핵 속의 염색질이 진 하게 염색되어 있으며, 핵막이 2중 막으로 선명하게 관찰되 었다. 핵막 주변에서 관찰되는 단백질 복합체인 리보솜이 소포체에 붙어있는 모습이 확연히 관찰되었다. 골지체와 미 토콘드리아의 형태도 방사선에 손상된 모습을 확인할 수 없 었다(Fig. 9 C). 미토콘드리아에서는 분비과립들이 관찰되고 지방소적도 선명하게 확인된 것으로 나타났다(Fig. 9 D).

Ⅳ. 고 찰

생식세포에서 난소의 난모세포는 정자세포와는 달리 탄 생의 시점에서 한정되어 있으며 점차 감소한다[19]. 따라서 일정 선량 이상의 방사선에 피폭되어 손상을 받으면 상해 받은 난소에서 난모세포의 재생을 볼 수 없다. 태생 기에는 난소 내에 1개의 난자를 함유한 원시세포가 다수 형성되고 출생 시에는 좌우 난소에 약 40만 개가 있다. 난자의 형성과 정은 난조세포에서 증식 분화되어 제1난모세포가 되고 감수 분열을 하여 제2난모세포로 이어지며, 2차 감수분열을 통해 난자로 배란된다[20]. 이러한 분열 과정이 복잡한 세포는 더욱 방사선에 민감하게 작용한다. 연구보고에 의하면 생쥐 에 3.5 Gy를 전신피폭하면 난자와 여포세포는 3일 후 핵이 농축되고 공포가 형성되어 변성된다고 하였다[5]. 방사선 감수성도 난자형성 초기에 높고 황체, 간질세포, 여포세포 난자의 순으로 낮아진다고 보고되었다. 인체에 있어 영구 불임을 일으키는 난소선량은 4 Gy로 보고되고 있다[5].

본 연구에서도 방사선 피폭 후 15일 지난 난조세포에서 세포막이 손상되고 간질세포에 형성된 섬유모세포도 가장 자리의 형태가 변화된 것으로 관찰되었다. 또한 핵막 안쪽 에서 공포화가 관찰되고 핵주변의 소기관인 조면소포체에 서 리보좀이 분리된 것으로 확인되었다. 내 난포막을 구성 하는 세포질에는 지방과립이 엉켜서 가장자리가 선명하게 관찰되지 않았다. 20일 경과된 조직에서는 지방소적들이 많 이 분포되어 과립이 형성되는 것을 볼 때 다음 단계로 진행 하기 위한 에너지 저장을 하는 것으로 보였다. 또한 방사선 에 의해 손상된 낡은 세포 소기관과 노폐물 및 식작용의 산 물들을 소화하는 2차 리소좀이 확인되어 스스로 보호하는 것으로 판단된다. 이러한 현상은 방사선에 의한 apoptosis 가 일어나는 과정으로 보여 진다. 30일 경과된 난소조직에 서는 미토콘드리아의 내외막이 분리되고 공포화로 부풀어 져 있었으며 이중막의 형태가 엷게 비후된 것으로 확인되어 손상이 더 심한 것으로 나타났다. 이후 40일에서는 지방소 적들의 형태가 일그러져 달라붙은 모습을 보였으며 소기관 들의 손상은 더욱 심한 것으로 확인되었다. 한편 마늘 성분 의 알리인을 정맥 투여한 실험의 조직에서는 방사선 조사 후 15일된 난조세포에서 일부 세포막이 위축되어 있었으나 주변 섬유모세포와 소기관들의 손상은 심각한 형태의 변화 는 관찰되지 않았다. 알리인 투여 후 30일 경과된 조직관찰 에서는 내 난포막을 구성하는 세포질에 정상적인 지방소적 이 많이 분포되어 있었으며 분비과립이 증가되는 것으로 보 아 성선자극호르몬의 분비가 촉진되는 것으로 보였다.

따라서 본 연구 결과 방사선의 피폭에 대한 영향이 난소 에서 난조세포에 크게 손상을 주어 다음 단계의 성장에 장 해를 초래하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 출생 이 후 한정되어 있는 생식세포에서 방사선에 대한 방어는 더욱 필요하다고 보여진다. 또한 천연방어 물질인 알리인의 방어 효과에서도 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 지금까지 알려진 혈소판의 연구와 간세포에서 밝혀진 연구 결과와 일치하는 방어효과를 확인하였다. 그 중 세포막과 핵막의 보호효과가 가장 크게 작용한 것으로 확인되었으며, 미토콘드리아, 조 면소포체 등의 소기관들에 대한 보호효과도 확인되었다. 따 라서 향후 새로운 연구 방식으로 방어효과를 확인한다면 천 연물질 방호제로서 충분한 역할을 할 것으로 판단된다.

Ⅴ. 결 론

난모세포로 성장하는 과정에서 7 Gy 방사선에 의한 영향 은 초기 미분화된 세포에서 손상이 큰 것으로 확인되었다.

따라서 난소조직의 방사선에 의한 손상은 초기 난조세포 와 주변 소기관들에서 손상이 많았으며, 알리인의 방호효과 도 확인할 수 있었다.