Ⅰ.서 론
방사선 전신조사 후 가장 민감하게 작용하는 기관은 생식 기관과 조혈기관 및 점막으로 구성된 조직으로 알려져 있다 1). 그 중 간은 중등도의 방사선감수성을 가지고 있지만 혈액 이 많이 분포되어 혈전이나 출혈이 발생되어 장해를 일으킨 다. 지금까지 알려진 연구결과에 의하면 7.5 Gy 1회 조사에 서 간의 크기가 일시적으로 비후되고 이후 위축되어 간경변 이 발생하는 것으로 알려져 있다2). 간조직의 위축은 세포가 광범위하게 파괴되어 간소엽의 규칙적인 배열이 붕괴되고 딱딱한 섬유질이 들어차 굳어지는 것이다. 이러한 방사선 피폭에 의한 간조직의 손상과 장해는 조직의 경화성 위축으 로 인한 복수를 초래하여 황달로 진행된다2,3). 하지만 지금 까지 방사선피폭에 의한 연구는 병적인 부분과 장해에 초점 이 맞춰져 있어 초미세구조를 통한 간 세포의 기초적인 손 상 기전은 연구가 부족한 실정이다. 특히 세포를 구성하고 있는 소기관들의 형태적 변화가 우선적으로 연구되어야 한 다. 그중 에너지를 생산하는 미토콘드리아와 세포질그물, 용해소체, 핵막 등의 연구와 더불어 소기관을 감싸고 있는 세포막에서 인과 지질에서의 감수성에 따른 형태적 손상도 규명되어야 한다. 이러한 간세포의 소기관들에서 각각의 손 상 위치와 형태적인 변화는 간조직의 기능 장해를 연구하는 데 매우 필요하다. 더불어 손상을 최소화하기 위한 방어제 성분은 손상 기전을 연구하는데 중요한 기초 자료가 된다.
지금까지 확인된 방사선 방어제는 SH 화합물로 선량감소 비율이 높지만 약물에 대한 부작용이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 천연 방어제로 인삼, 프로폴리스 등이 많이 연 구되어 효과가 일부 확인되었으나 정량적인 부분에서는 연 구가 부족한 실정이다4-8). 따라서 정제된 천연물질을 활용 하여 정확한 양으로 정맥혈관에 투여한 후 방어효과를 확인 할 필요가 있다. 최근 연구 보고에 의하면 전신 방사선 5 Gy 조사 후 천연물질인 알리인을 흰쥐의 정맥혈관에 투여하여 혈소판의 방어효과를 초미세구조로 확인한 연구가 보고되 었다9). 연구에 의하면 알리인 투여군이 방사선 조사군에 비 해 세포막의 손상이 적었으며 소기관들도 선명하게 관찰되 었고, 1차, 2차 과립의 수와 형태도 정상적으로 관찰된 것으 로 보고하였다9). 이러한 알리인은 마늘성분으로 면역력을 증가시키고 혈관세포의 신진대사를 원활하게 하며 혈류 증 가를 향상시키는 것으로 알려져 있다10-12). 마늘의 효과에 대한 성분 분석은 1892년 제믈러(독일)가 최초로 분석하였 으며, Diallyl Disulfide/DADS 라는 Alliin 물질이라고 규 명하였다13). 특히 혈관과 혈액의 비중이 높은 간 조직에서 알리인을 활용한 방어효과 연구는 필요한 것으로 판단된다.
따라서 본 연구는 전신 방사선 피폭 시 간 세포에서 핵과 세포질 및 소기관들의 손상 형태와 저항성과 감수성 변화를 알아보고 소기관의 손상 시 최소화 할 수 있는 연구를 위해 마늘성분의 알리인을 투여하여 투과전자현미경을 통한 초 미세구조로 방어효과를 알아보고자 하였다.
Ⅱ.재료 및 방법
1.실험동물의 준비 및 방사선조사
실험동물은 200~250 g의 흰쥐는 24마리를 대조군과 실 험군으로 나누어 방사선 조사와 알리인 투여를 실시하였다. 실험방법은 방사선 조사 후 15일, 20일, 30일, 40일 간격으 로 대조군과 실험군을 희생시킨 후 간 조직을 적출하여 시 료로 사용하였다.
방사선조사는 가로 30 cm × 세로 30 cm로 특수 제작한 상자에 넣고 윗 부분은 투명 아크릴로 덮고 높이를 같게 하 였다. 방사선 조사는 선형가속기(Clinac 21 EX-S, USA, 2006)을 이용하여 6Mev X선으로 대향이문조사를 실시하 였다. SSD는 98 cm으로 고정하고 심부 선량을 2 cm로 한 다음 전신 7Gy로 X선을 조사하였다. Table 1
2.방어효과를 위한 알리인 투여
간조직의 방사선 방어효과를 알아보고자 사용된 시약은 SIGMA-ALDRICH Korea에서 구입한 알리인(Synonym: 3-(2-Propenylsulfinyl)-L-alanine, S-Allyl-L-cysteine sulfoxide, L-Alliin)을 사용하였다. 본 실험에 사용된 알 리인의 성분 분리는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 정제된 것으로 90% 이상으로 동결 건 조된 분말 10mg을 2개를 사용하였다. 알리인의 투여는 흰 쥐를 고정틀에 고정시킨 후 꼬리정맥을 통하여 투여하였다. 투여량은 생리식염수 5ml에 알리인 분말 10mg을 희석하 여 방사선 조사 전 흰쥐 한 마리당 희석된 1ml, 즉 알리인 2mg을 정맥 주사하였다.
3.간세포의 투과전자현미경 시료제작
간 조직의 시료제작을 위해 약품처리는 glutaraldehyde (2.5%, Polyscience)에서 3시간 동안 전고정하고, osmmium tetraoxide (1%, Polyscience)로 1시간 30분 후 고정 하였 다. 이후 ethyl alcohol (Merck)을 사용하여 계대 탈수과정 을 시행하고, propylene oxide (Merck)로 치환하였다. 그 리고 epon resin (polyscience)에 포매하여 60℃ 배양기에 서 48시간 중합하여 block을 제작하였다. ultra microtome (Leica, Ultra-S, 2003)을 이용하여 80 nm로 박절 후 uranyl acetate (Polyscience)와 lead nitrate (Polyscience)로 이 중 염색하여 투과전자현미경 (H-7000, Hitachi, Japan)을 통하여 관찰하였다.
Ⅲ.결 과
1.정상 간 조직 세포의 투과전자현미경 관찰
간세포를 관찰한 결과, 다각형의 구조 크기가 20~30㎛ 관찰되었다. 핵은 1개 또는 2개의 핵을 가지고 있는 것도 있 었다. 간세포는 느린 속도로 교체되는 기관이지만 재생능력 이 뛰어나기 때문에 핵 주변에 당 대사에 과정에서 필요한 에너지를 공급하기 위한 미토콘드리아(mitochondria; M) 가 세포당 800개까지 존재하는 것으로 확인되었으며, 과산 화소체(peroxisome; P)와 구별이 어려울 정도로 크기가 비 슷하게 분포되어 있는 것으로 관찰되었다(Fig. 1A). 일부 세 포에서는 뭉친 염색질이 핵질내에 덩어리를 이루고 있었으 며 글리코겐(glycogen; GI)이 세포질 전체에 가득하게 관찰 되었고, 골지체와 자가용해소체도 확인되었다(Fig. 1B). 간 세포의 핵주변에는 단백질을 합성하고 아미노산을 글루코 스로 전환하는 리보솜(ribosome; r)이 붙은 과립세포질그 물망(rough endoplasmic; rER)이 풍부하게 산재되어 있는 것으로 관찰되었다(Fig. 1D). 무과립세포질그물망(smooth endoplasmic reticulum; sER)은 세포막 주변에서 넓게 분 포되어 있었으며 콜레스테롤 지질단백 등이 포함되어 있는 지방모세포(lipoblast; L)를 만든다. 또한 효소와 독소 및 약물의 파괴와 접합에 관여하고 있어 노출되면 세포내 소기 관 중 가장 많은 부분을 차지하고 비대하게 된다. 핵막 (nuclear membrane; NMb)은 선명한 이중막으로 관찰되었 고 경계도 선명하게 확인되었다(Fig. 1D). 세포막 주변에는 적혈구가 포함된 혈관들이 관찰되었으며, 혈액 중의 포도당 값이나 운동량 등에 따라 변하는 글리코겐(Gl)이 검은 점의 형태로 가장 많이 관찰되었다. 단백질성 점액성 선세포의 분비물형성에 관여하여 당질을 결합시켜주는 골지체(golgi body; Gol)는 드물게 보였으며, 가수분해효소가 풍부하 여 불포화물을 세포외에 내보는 역할을 하는 용해소체 (lysome; Ly), 자가용해소체(autolysome; ALy)도 관찰되 었다.
2.7 Gy 방사선 조사 후 간세포의 투과전자현미경 관찰
방사선 조사 후 15일 경과한 간세포의 투과전자현미경 관 찰에서는 핵주변의 미토콘드리아와 과산화소체가 한쪽부분 에 집중적으로 뭉쳐있었으며 가장자리의 경계도 선명하게 확인되지 않았다. 또한 염증반응(Imp)으로 보여지는 짙은 부분들이 미토콘드리아 주변에서 확인되었다. 소기관들의 가장자리 막에서도 부분적으로 비후되거나 일부 소실된 것 으로 관찰되었다(Fig. 2A). 핵의 크기와 염색질의 변화는 차이가 없었다. 조면소포체(rER)도 핵 주변에서 관찰되었 으나 대조군에 비해 풍부하지 않았으며 주변부위에서 옅게 짙은 음영으로 관찰되었다. 미토콘드리아의 수는 정상 간세 포에서 관찰되는 만큼 다양하게 관찰되었으며, 일부 글리코 겐이 미토콘드리아 가운데에서 들어간 것으로 관찰되었다 (Fig. 2B). 20일된 간세포 관찰에서는 핵막이 두껍게 확인 되고(NMBk) 과산화소체와 미토콘드리아의 막이 경계를 알 아보지 못할 만큼 손상된 것으로 확인되었다. 또한 세포질 에 있는 소기관들 사이에는 공포(v)가 생겨 소기관이 파괴 되거나 소실된 것으로 관찰되었다(Fig. 2C). 과산화소체 (P)는 간세포에서 많이 확인되는 소기관으로 간의 지방산 을 산화시켜 에너지원으로 활용하는 것으로 20일 경과된 관찰에서는 가장자리가 일부 손상되고 내용물이 균일하게 분포되지 않아 기능적 장해 손상이 있는 것으로 관찰되었 다(Fig. 2D).
방사선 조사 후 30일이 경과된 관찰에서는 지방모세포(L) 의 크기가 핵의 크기만큼 커진 것이 관찰되고 작은 지방조 직들도 세포질 내부에 많이 관찰되어 대사 이상으로 인한 간세포의 활동이 줄어들고 과잉 에너지가 트리아실글리세 롤 형태로 지방세포로 축적된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). 또한 과산화소체의 수는 줄어들고 세포질에는 활면소 포체가 증가되어 있었으며 세포의 구조물 중 사립체와 소포 체 등이 생리적 병적으로 자가융해되는 과정에 있는 자가융 해소체(ALy)가 선명하게 관찰되었다(Fig. 3 B). 40일된 간 세포에서는 리보솜(r)이 조면소포체에서 분리되어 핵 주변 에서 관찰되고 미토콘드리아의 막도 일부 소실되어 가장자 리의 형태가 선명하게 확인되지 않았다. 세포질에는 글리 코겐이 일부 관찰되었으나 공포화 된 부분이 많이 생겨 소 기관들의 손상의 정도가 큰 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3C, D).
3.알리인 투여 후 7 Gy 조사한 간세포의 투과전 자현미경 관찰
방사선 조사 전 알리인 투여 후 15일된 간세포는 핵막주 변에 조면소포체가 선명하게 나타났으며, 단백질합성이 완 성한 것으로 관찰되었다. 미토콘드리아의 관찰에서는 소포 체 가장자리에 위치한 경우는 경계가 분명한 모습으로 보 였으나 일부에서는 막의 구분이 분명하지 않는 부분도 확 인되었다. 핵막은 이중막으로 뚜렷하게 관찰되었다. 20일 경과한 간세포의 조면소포체 관찰에서는 수가 증가되었으 며 대부분이 손상되는 않는 모습으로 선명하게 보여 대조 군과 같이 세포활동을 왕성하게 하는 것으로 확인되었다 (Fig. 4A, B).
알리인 투여 후 30일 된 간포는 지방모세포들이 선명하게 관찰되고 소기관들의 위치 및 배열이 대조군과 같이 분명하 게 확인되었다. 방사선에 의해 손상된 소기관들은 거의 관 찰되지 않았다. 또한 글리코겐이 더욱 많이 증가되어 간 조 직에서 혈중 포도당 대사의 합성과 분해가 촉진되는 것으로 나타났다(Fig. 5A,B). 40일된 세포에서는 조면소포체와 미 토콘드리아가 더욱 가득하게 관찰되고 파괴되거나 손상된 소기관들은 관찰되지 않았다. 소포체에 붙어있는 리보솜은 더욱 선명하게 보였으며 40,000배 확대한 영상에서도 미토 콘드리아의 내부와 외부 형태적인 손상이 없는 것으로 확인 되었다. 또한 다른 소기관들에서도 특별한 이상 소견은 관 찰되지 않아 알리인에 방어효과가 있는 것으로 확인되었다 (Fig. 5C, D).
Ⅳ.고 찰
방사선에 의한 소기관 손상을 초미세 구조로 규명한 연구 는 부족한 실정이다. 특히나 세포막의 구조가 유동모자이크 모델로 소개되는 것을 볼 때 손상된 핵막과 세포막의 손상 기전을 형태학적으로 밝힌다는 것은 아직까지 해결하지 못 하는 과제이다. 본 연구에서도 인과 지질로 구성으로 되어 있는 세포막에서 방사선에 의한 손상이 인의 파괴로 발생되 는지 지질의 과산화에 의해 일어났는지는 확인되지 않았다. 하지만 지등이 연구한 연구보고서에 의하면 5 Gy 전신 방사 선 조사 후 혈구의 관찰 결과 5일 경과 된 혈소판에서 막손 상이 확인되었으며, 20일 경과에서는 세포질의 내용물이 유 출되고 30일 경과에서는 과립들의 손상된 것으로 보아 가장 민감하게 작용하는 것이 막손상에서 발생된다는 것을 확인 할 수 있었다4).
본 실험에서도 방사선 조사군에서 세포의 크기가 줄어든 것으로 확인되었으며 세포와 세포사이 간질에서 관찰되는 혈관도 위축된 것으로 나타났다. 핵의 모양도 완만한 타원 형에서 쭈글쭈글한 모습을 보이고 세포소기관들은 한쪽에 뭉쳐서 겹겹 보이는 부분도 관찰되었다. 방사선 피폭 후 15 일된 간세포에서 급성간장해로 보이는 진한 음영으로 세포 질에서 확인되는 염증성 부분도 확인되었다. 시간이 20일로 경과할수록 세포질에서 공포화 된 부분이 생기고 소기관들 의 막도 파괴된 모습으로 관찰되었다. 30일 경과된 세포에 서는 지방모세포들이 핵의 크기만큼 커다랗게 커져있는 거 대구조물들이 관찰되었는데 이는 대사과정에서 간의 기능 이 정상적으로 이루어지지 않고 에너지 저장의 형태로 저장 되는 것으로 추측된다. 40일째 되는 간세포에서는 공포화 된 세포질의 모습들이 많이 관찰되고 소기관들의 막도 선명 하지 않고 비후된 모습으로 보여 간세포에 확실한 방사선 장해를 확인할 수 있었다. 지금까지 세포손상의 방어에 관 한 연구에서는 프로폴리스가 X선에 노출된 마우스 정소에 미치는 영향에서 일부 방어효과가 있는 것으로 확인되었으 며14), 홍삼추출물을 사용하여 감마선 조사 전에 투여하면 신장 내 Cu, Zn-SOD(27.8%) 및 Mn-SOD(31.9%)의 활성 이 증가되며, 지질과산화의 함량이 81% 감소되었다고 보고 되었다15).
본 연구 결과에서도 알리인 투여가 방사선 피폭에 의한 세포 손상을 줄일 수 있는 것으로 확인되었다. 특히 핵 주변 의 소기관 관찰에서 조면소포체와 미토콘드리아가 대조군 과 차이가 없었다. 또한 글리코겐이 미토콘드리아 주변에 많이 관찰된다는 것은 물질대사와 에너지 대사 활동이 잘 이루어진다는 것을 의미한다. 따라서 세포의 단백질 합성 기능이 정상적으로 이루어지는 것으로 판단할 수 있다. 형 태학적으로 배율을 X40,000배 증가하여 관찰한 영상에서 도 핵막이 이중막으로 선명하게 관찰되었으며 미토콘드리 아의 막도 손상되지 않는 것으로 확인되었다(Fig. 5D). 이 러한 결과를 종합해 볼 때, 본 연구는 방사선 피폭에 의한 간세포의 손상을 초미세구조로 명확하게 규명하였으며, 알 리인의 방어효과를 일정부분 확인할 수 있었다. 본 연구자 는 이번 연구가 간세포 손상의 기초적인 학술자료로 활용되 기를 기대한다.
Ⅴ.결 론
간세포에 방사선이 피폭되면 핵의 모양이 응축되고 세포 질에서 염증성 변화를 확인할 수 있었다. 7 Gy 조사 후 20 일 경과된 세포에서는 미토콘드리아 막이 파괴되고 세포질 에서 공포화가 관찰되었다. 30일 경과한 세포에서는 거대 지방조직들이 관찰되고 조면소포체가 끊어지고 리보솜이 분리된 것으로 확인되었다. 알리인 투여한 간세포에서는 조 면소포체가 핵막주변에 선명하게 관찰되었으며 글리코겐이 증가된 것으로 확인되었다.
